Determinare il profilo di composti organici volatili degli insilati per valutarne la qualità fermentativa

Una survey sulla presenza di composti organici volatili negli insilati della Pianura Padana (Italia).

Nell’ambito della nutrizione animale la tecnica dell’insilamento è ampiamente usata per ottenere un alimento fermentato e ad alta umidità da somministrate ai bovini da latte (Kalač, 2011). In particolare, una delle condizioni più importanti per garantire la qualità dell’insilato, è l’instaurarsi e il successivo mantenimento di anaerobiosi (Kung et al., 2018). Questa particolare condizione di assenza di ossigeno nella massa insilata permette la crescita di batteri lattici a discapito di altri microrganismi indesiderati che competono con essi per l’uso di alcuni nutrienti per la crescita. Tali microrganismi desiderati sono notoriamente produttori di acido lattico e in misura minore di acido acetico, due composti essenziali per aumentare l’acidità della massa insilata ostacolando l’insorgere di fermentazioni indesiderate (McDonald et al., 1991). Per la valutazione della qualità fermentativa degli insilati, si usano comunemente parametri quali pH, concentrazione di principali acidi organici e di alcuni alcoli, azoto ammoniacale e conteggio di popolazioni microbiche, che permettono di comprendere i pathway fermentativi che si sono instaurati nel corso del periodo di conservazione e successivamente di de-silamento (Kung et al., 2018). 

Questa generale valutazione si concentra su alcuni dei composti organici volatili (VOC) che si possono sviluppare; tuttavia, il processo dell’insilamento è molto più complesso e un gran numero di VOC si generano come prodotto finale o intermedio di altre fermentazioni. Secondo lavori recenti (Hafner et al., 2013; Chemlova ´et al., 2009; Daniel et al., 2013; Weiss, 2017) i composti volatili che si sviluppano possono essere attribuiti a quattro principali categorie ovvero alcoli, aldeidi, chetoni ed esteri. Lo studio di questi composti supportato da metodi analitici basati sulla gascromatografia (GC), ha visto un crescente interesse per determinare un profilo fermentativo più completo nei foraggi insilati (Weiss e Sommer, 2012; Weiss et al., 2016; Gomes et al., 2019) nonché per lo sviluppo di indici di qualità fermentativa (Gallo et al., 2016b; Andrighetto et al., 2018; Tharangani et al., 2021).

Nel presente studio si è deciso dunque di analizzare diverse matrici di insilati e fasciati per determinare la produzione di VOC, valutando le relazioni tra i diversi prodotti di fermentazione tramite uso di tecnica statistica multivariata come l’analisi delle componenti principali (PCA). Questa analisi è stata condotta sui composti quantificati grazie allo sviluppo di un metodo basto su GC/FID che è risultato essere sensibile, accurato e veloce per determinare, in un’unica corsa cromatografica, un gran numero (48 in totale) di VOC.

Nello studio condotto, sono stati analizzati 111 prodotti insilati così ripartiti:

• 10 insilati di mais;
• 7 insilati di sorgo;
• 10 insilati di cereali autunno-vernini;
• 8 insilati di erba medica;
• 8 insilati di loietto;
• 10 insilati di erbai misti leguminose-graminacee;
• 11 fasciati di erba medica;
• 8 fasciati di leguminose;
• 20 fasciati di erba;
• 19 fasciati di erbai misti leguminose-graminacee.

I campioni provengono da aziende collocate nell’areale della Pianura Padana nelle annate 2020-2021 e sono stati campionati almeno 10 settimane dopo l’insilamento. I VOC sono stati determinati a partire dall’estratto liquido del campione (rapporto 1:3, campione:acqua bidistillata) tramite analisi con GC/FID per i VOC e mediante cromatografia ad alta prestazione liquida (HPLC; Carvalho et al., 2012) per l’acido lattico. Sono anche stati determinati pH, sostanza secca e azoto ammoniacale. Il metodo proposto si basa sull’utilizzo di un GC Shimadzu 2025 (Shimadzu S.r.l., Milano, Italia) dotato di autocampionatore (AOC-20i Shimadzu S.r.l., Milano, Italia), rivelatore FID e colonna capillare DB-WAX UI (60 m × 0,250 mm; 0,25 µm; Agilent Technologies S.p.A., Milano, Italia). I VOC nei campioni di insilato sono stati identificati tramite confronto con i tempi di ritenzione degli standard esterni e calcolati attraverso le aree di picco (corrette con i fattori di risposta strumentale, RF; AOAC, 2000) utilizzando l’area di picco dell’acido pivalico come standard interno a concentrazione nota (Fussell e McCalley, 1987). I VOC sono stati espressi in mg/kg di sostanza secca (DM).

L’analisi delle componenti principali ha permesso di estrarre ed interpretare dal punto di vista biologico 7 fattori riconducibili a microrganismi che si sono sviluppati nella massa insilata. Questi fattori (F) che hanno permesso di raggruppare i composti organici volatili determinati con il metodo da noi proposto, sono stati denominati nel testo come segue:

• “clostridi” per F1, 
• “enterobatteri, bacilli e clostridi” per F2, 
• “lieviti e batteri lattici eterofermentativi facoltativi (LAB)” per F3, 
• “lieviti” per F4, 
• “LAB eterofermentativi obbligati e facoltativi” per F5, 
• “lattococchi” per F6, 
• “batteri eterofermentativi obbligati” per F7.

In particolare, alcuni AGV (cioè gli acidi iso-valerico, iso-butirrico, valerico e butirrico), l’acetato di isoamile con propil butirrato, il propil acetato e l’azoto ammoniacale erano ascrivibili al fattore “clostridi”. I composti che erano coinvolti nel fattore “enterobatteri, bacilli e clostridi” sono stati acidi valerico e butirrico, il metil ed etil butirrato, il 2,3-butaneldiolo, l’1-butanolo e il 2-butanolo. Alcuni alcoli (cioè 2-metil-1-propanolo, 2-metil-1-butanolo, 3-metil-1-butanolo, 2-fenil-etanolo e metanolo) erano correlati al fattore “lieviti e LAB eterofermentativi facoltativi”, mentre l’etanolo, insieme all’etil-lattato e all’etil-acetato, erano le variabili di importanza nel fattore “lieviti”.

Gli acidi acetico e lattico, insieme all’1,2-propandiolo, sono stati correlati positivamente al fattore “LAB eterofermentativi obbligati e facoltativi”, mentre il pH e il DM sono stati correlati negativamente al medesimo fattore. La 2-metilpropionaldeide e la 2-metilbutirraldeide facevano parte del fattore “lattococchi”.

I composti con importanza sul fattore “batteri etero-fermentativi obbligati” sono stati il propionato di etile, l’acido propionico, l’1-propanolo e il propil acetato. In particolare, si sono riscontrate delle differenze sulla base delle matrici analizzate e i fattori estratti.

L’erba medica fasciata, seguita dall’insilato di loietto, si differenziava (P < 0,05) dalle altre categorie di insilati per il fattore “enterobatteri, bacilli e clostridi”. Gli insilati e i fasciati contenenti leguminose, ad eccezione degli insilati di colture miste, hanno mostrato valori dei fattori più elevati (P < 0,05) rispetto agli altri gruppi per quanto riguarda i “lieviti e LAB eterofermentanti facoltativi”. I prodotti fermentati contenenti colture erbacee, ad eccezione degli insilati di colture miste e di sorgo, si sono differenziati (P < 0,05) dalle altre categorie sul fattore “lieviti”.

Nell’ambito del fattore “LAB eterofermentanti obbligati e facoltativi”, tutti gli insilati a base di colture erbacee o che ne fanno parte avevano valori di fattore più elevati (P < 0,05) rispetto agli altri prodotti fermentati. Gli insilati di erba medica e di colture miste, insieme ai fasciati di erba e di colture miste, hanno mostrato medie dei fattori più basse (P < 0,05) rispetto alle altre categorie sul fattore “Lattococchi”.

L’attribuzione dei fattori è stata condotta sulla base dei composti volatili che insistevano su di esse. In particolare, la presenza di clostridi attribuibile al fattore 1 è stata caratterizzata da abbassamento del pH che può subire una risalita a causa della fermentazione di acido lattico in acidi più deboli e concomitante degradazione di proteine ed amminoacidi (Wilkinson, 2005). Il rischio di queste fermentazioni secondarie aumenta nelle colture (Wilkinson, 2005) quando abbiamo un contenuto di DM inferiore (DM<20%), un contenuto di zuccheri relativamente basso (< 30 g di carboidrati idrosolubili/ kg di peso fresco), un’elevata capacità tampone (> 400 mEq/ kg di DM) e/o una bassa concentrazione di nitrati (< 10 g di NO3/ kg di N totale). Inoltre, la presenza di butirrico in questo fattore è dovuto al fatto che sia i clostridi saccarolitici (Clostridium tyrobutyricum, C.butyricum e C.beijerinckii) che, in misura minore, i proteolitici (C. bifermentas, C.sporogenes) possono produrre questo acido (Buxton e O’Kiely, 2003; Dunière et al., 2013) con particolare attribuzione di acido butirrico (Vissers et al., 2007) e valerico (Gómez-Torres et al., 2015) al metabolismo del Clostridium tyrobutyricum.

Inoltre, Takeda e Furusaka (1975) hanno riferito che Clostridium spp. produce acidi grassi a catena ramificata, come l’acido iso-valerico e iso-butirrico, con Clostridium indologenes, Clostridium putrefaciens e Clostridium capitovale in grado di produrre iso-valerico e ammoniaca mediante la reazione di Stickland a partire da leucina e prolina. Durante il processo di insilamento, la comunità microbica influisce fortemente sulla qualità dell’insilato e, in questo senso, la fermentazione clostridica deve essere evitata in quanto responsabile del deterioramento dell’insilato, nonché dello sviluppo di un odore rancido indesiderato e dell’accumulo di ammoniaca e ammine (Li et al., 2020). Tuttavia, dal presente studio non si sono evidenziate differenze tra le diverse classi di insilati in base a questo fattore legato alla presneza di composti riconducibili ai clostridi.

L’1-butanolo, insieme agli acidi butirrico e valerico, sono rientrati nel fattore “enterobatteri, bacilli e clostridi”. I risultati di questa analisi hanno dimostrato che la fermentazione indesiderata legata ai clostridi si è verificata principalmente nei fasciati di erba medica e nell‘insilato di loietto. D’altra parte, queste colture sono particolarmente difficili da insilare a causa dell’elevata capacità tampone e del basso contenuto di zuccheri per l’erba medica (McDonald et al., 1991), e dell’umidità (Yan et al., 2014) e della contaminazione del suolo (Queiroz et al., 2018) per l’erba medica e il loietto. Inoltre, la presenza di 2,3-butandiolo è dovuta alla fermentazione acido-mista, caratteristica della maggior parte dei microrganismi appartenenti alle Enterobacteriaceae che producono questo composto per contrastare condizioni di crescita acide. Tuttavia, è altresì nota la capacità dei LAB di produrre 2,3-butandiolo (Ghiaci et al., 2014, Hieke e Vollbrecht, 1974). Silva et al. (2019), infatti, hanno osservato una forte correlazione tra la concentrazione di 2,3-butandiolo nell’insilato e l’inoculo di Lentilactobacillus buchneri; pertanto, non si può escludere la presenza di LAB che possiedono anch’essi la capacità di sintetizzare il 2,3 butandiolo.

Il terzo fattore è stato etichettato biologicamente come “lieviti e LAB eterofermentativi facoltativi”. Alcuni alcoli a catena ramificata sono prodotti dai LAB attraverso il catabolismo degli aminoacidi (Edwards e Peterson, 1994, Silva e Malcata, 1998, Hafner et al., 2013), gli alcoli a catena ramificata invece possono essere prodotti dai lieviti (Hazelwood et al., 2008).

La presenza invece di metanolo nei prodotti insilati è attribuita all’attività degli enzimi vegetali prima dell’insilamento ed è uno dei prodotti finali del metabolismo della pectina da parte di microrganismi (Siragusa et al., 1988, Nakagawa et al., 2000, Alvarenga et al., 2011). Tuttavia, è stato anche dimostrato che lieviti possono produrre metanolo durante la fermentazione tradizionale (Dato et al., 2005). Nonostante ciò, la formazione di metanolo nell’insilato è più probabile che avvenga attraverso l’azione di pectinesterasi e poligalatturonasi, responsabili della de-esterificazione della pectina nelle piante superiori (Birch et al., 1981, Hou et al., 2008) a causa del danneggiamento delle cellule vegetali durante la raccolta e la trinciatura delle piante di mais per l’insilamento.

La componente attribuibile ai lieviti vede l’etanolo come uno dei prodotti della fermentazione di questi microrganismi a partire dallo zucchero come substrato (Driehuis e Elferink, 2000), mentre l‘acetato di etile potrebbe essere sintetizzato da alcune specie di lieviti (Nordström, 1966, Fredlund et al., 2004, Park et al., 2009, Kruis et al., 2017) che sono notoriamente presenti negli insilati (Pahlow et al., 2003). Inoltre, questo composto può essere legato alle buone pratiche di insilaggio, infatti Brüning et al. (2018) hanno riportato che le concentrazioni di acetato di etile e lattato di etile potrebbero aumentare con la chiusura ritardata della trincea in quanto i lieviti potrebbero moltiplicarsi durante questa fase causando la formazione diretta di esteri di etile (acetato di etile e lattato di etile) o produrre etanolo per esterificazione.

Il carico di VOC che sono sulla componente “lieviti” ha mostrato valori medi più bassi nei prodotti fermentati contenenti leguminose (ad eccezione del fieno di colture miste). Ciò potrebbe essere attribuito all’eccessiva disponibilità di zuccheri che stimola la crescita dei lieviti (Adesogan e Newman, 2010) e, come è noto, le colture di legumi sono caratterizzate da una bassa concentrazione di carboidrati idrosolubili (Hattori et al., 1996).

Il quinto fattore è stato denominato “LAB eterofermentativi obbligati e facoltativi”. A tal proposito l’1,2-propandiolo e l’acido acetico sono stati associati alla via fermentativa dei LAB eterofermentativi obbligati, ma anche ai LAB eterofermentativi facoltativi che in condizioni specifiche (bassa disponibilità di glucosio) producono acetato. Inoltre, alti livelli di acido acetico e 1,2-propandiolo potrebbero essere ottenuti dall’inoculo dell’insilato con Lentilactobacillus buchneri, LAB eterofermentativo largamente usato per migliorare la stabilità aerobica (Schmidt et al., 2009, Oliveira et al., 2017). Nel presente studio, valori più alti di acido lattico e acetico riscontrati negli insilati contenenti colture erbacee concordavano con valori più bassi di pH misurati negli stessi campioni grazie alla capacità di questi acidi di inibire la crescita di microrganismi indesiderati abbassando il pH della massa insilata. 

La penultima componente è stata denominata “Lattococchi” per la presenza di 2-metilpropionaldeide e la 2-metilbutirraldeide. Le aldeidi ramificate possono essere prodotte dai LAB (Kranenburg et al., 2002; Liu e Siezen, 2006) che crescono in modo favorevole negli insilati. 

Infine, il fattore “batteri etero-fermentativi obbligati” è stato caratterizzato da VOC quali etil propionato, acido propionico, 1-propanolo e propil acetato, in accordo con Raun e Kristensen (2010), tramite una via specifica di produzione associata all’insilato e alla presenza di etero-fermentanti (McDonald et al., 1991, Raun e Kristensen, 2010). Inoltre, l’1-propanolo e l’acido propionico sono prodotti dominanti della degradazione microbica dell’1,2-propandiolo (Krooneman et al., 2002).

In conclusione, quindi, ai noti parametri fermentativi per lo studio della qualità degli insilati, si aggiungono questi composti organici volatili analizzati grazie al metodo sviluppato con uso di GC. Si è quindi evidenziato che tali composti possono essere raggruppati in fattori e poi studiati dando loro un senso biologico. Inoltre è stato possibile osservare che diverse matrici hanno prodotti di fermentazione differenti.

Il fieno di erba medica e l’insilato di loietto sono stati caratterizzati da VOC associati alle fermentazioni di enterobatteri, bacilli e clostridi. Le colture con leguminosa, tranne gli insilati di miscuglio, sono state caratterizzate da livelli più elevati di VOC riconducibili all’attività dei lieviti e dei LAB eterofermentativi facoltativi e da livelli più bassi di VOC derivanti dall’attività dei lieviti.

Negli insilati di graminacee, mais e sorgo erano presenti VOC legati alla fermentazione di LAB eterofermentativi obbligati e facoltativi. Inoltre, negli insilati di sorgo è stata osservata un’attività di clostridi. Attente analisi e interpretazione dei VOC permettono dunque di comprendere la qualità fermentativa dei prodotti insilati individuando pathway sulla base dei prodotti sviluppati nella massa insilata.

La presente nota è una sintesi del seguente articolo scientifico pubblicato su Animal Feed Science and Technology dove è riportata tutta la letteratura citata: Sigolo, S., Fancello, F., Ghilardelli, F., Mosconi, M., Prandini, A., Masoero, F., Yuan, X., Gallo, A., 2023. Survey on the occurrence of silage volatile organic compounds in the Po Valley-Italy. Animal Feed Science and Technoology, 297. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2023.115593

Autori

Giuseppe Conte, Alberto Stanislao Atzori, Fabio Correddu, Antonio Gallo, Antonio Natalello, Sara Pegolo, Manuel Scerra – Gruppo Editoriale ASPA