La stagionalità nella bufala è influenzata sia da fattori esogeni (fotoperiodo, clima, alimentazione, gestione) che da fattori endogeni (ormoni, genotipo). I bufali sono animali a fotoperiodo negativo e mostrano un naturale aumento della fertilità con la diminuzione del numero di ore di luce giornaliera. L’ormone melatonina, prodotto dalla ghiandola pineale (o epifisi), svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del fotoperiodo a livello cerebrale: questo infatti interviene controllando la secrezione annuale di gonadotropine e, di conseguenza, la funzione delle gonadi. Tuttavia, una parte di melatonina viene rilasciata nel circolo sistemico e, insieme alla melatonina prodotta a livello periferico, agisce sui tessuti somatici. Nelle ovaie e nei testicoli la melatonina agisce come antiossidante ed elimina i radicali liberi dell’ossigeno per ridurre sia lo stress ossidativo che l’apoptosi. Ciò ha effetti benefici sulla gametogenesi e la steroidogenesi. Le femmine trattate con melatonina mostrano una migliore risposta ai trattamenti di sincronizzazione dell’estro, in particolare quando applicati al di fuori della stagione riproduttiva. La melatonina agisce attraverso i suoi recettori MT1 e MT2 ed il gene per MT1 (MTNR1A) è polimorfico nella specie bufalina: polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nel gene MTNR1A hanno mostrato un’associazione con la fertilità nella bufala.

Perché è importante parlare di stagionalità?

Per oltre 5000 anni le bufale sono state tra i principali animali da allevamento ed il loro significato nei sistemi alimentari globali sta continuando a crescere. Oggi, i prodotti ottenuti dal bufalo si ritrovano agli estremi più costosi e meno costosi dei mercati alimentari. Il bufalo contribuisce con alimenti di elevato pregio e di nicchia, come la mozzarella, e rappresenta anche una fonte economica ed altamente nutriente di proteine di origine animale attraverso la sua carne. Quest’ultima è particolarmente importante in termini di sicurezza alimentare in Asia e Medio Oriente. La crescita della domanda di “manzo” di bufalo a prezzi accessibili consente ai piccoli proprietari e ad agricoltori con poca terra di partecipare ai mercati alimentari globali. Ciò crea l’opportunità di alleviare la povertà e migliorare i mezzi di sussistenza rurali nei paesi in via di sviluppo ed è estremamente rilevante per gli obiettivi legati ad uno sviluppo sostenibile.

La crescita delle produzioni di bufaline è limitata soprattutto dalla loro biologia riproduttiva: i bufali sono generalmente considerati tardivi per quanto concerne la maturità sessuale e con un lungo anaestro postpartum rispetto ai bovini. La selezione compiuta da oltre 30 anni nel bufalo Mediterraneo Italiano ha ridotto l’età al primo parto da 42 a 36 mesi e, con la gestione, si è raggiunto l’obiettivo di un’età al primo parto di 28 mesi. La bufala ha anche una gestazione più lunga (in genere 300-320 giorni) rispetto alla bovina (tra 279 e 283 giorni nel Bos taurus e tra 290 e 293 giorni nel Bos indicus). Le caratteristiche riproduttive della femmina, quindi, rendono molto difficile che questa sia in grado di produrre un vitello all’anno.

Accanto a queste caratteristiche va aggiunto il fatto che la specie bufalina è una specie stagionale a fotoperiodo negativo, per cui mostra delle naturali fluttuazioni del tasso di fertilità nel corso dell’anno. Inoltre, la stragrande maggioranza della popolazione bufalina si trova in aree tropicali e subtropicali, dove alte temperature e umidità in estate, insieme ad nutrizione relativamente scarsa, causano il fenomeno dell’anaestro stagionale. I fattori ambientali possono, tuttavia, essere relativi poiché in Italia la bufala Mediterranea viene allevata mantenendo condizioni alimentari ed ambientali costanti nel corso dell’anno.

Tuttavia, la stagionalità riproduttiva è una condizione che determina delle importanti ripercussioni economiche, anche nei Paesi industrializzati come l’Italia. Nel nostro Paese, infatti, il latte bufalino è interamente destinato alla produzione di mozzarella di bufala, formaggio a pasta filata che viene consumato principalmente nel periodo primaverile-estivo. Per assicurare la produzione di latte in questo periodo, quindi, è necessario che gli accoppiamenti degli animali avvengano al di fuori della stagione riproduttiva, quando incrementano le ore di luce giornaliera. Ne consegue che la profonda conoscenza dei fattori che intervengono nella regolazione della stagionalità riproduttiva riveste un’importanza fondamentale.

Quali sono i fattori da tenere in considerazione?

Come accennato in precedenza, la stagionalità riproduttiva della bufala è regolata da fattori esogeni ed endogeni. I fattori esogeni che influenzano la funzionalità riproduttiva sono stati ampiamente discussi da vari autori. Il fotoperiodo è probabilmente il principale regolatore esogeno della riproduzione. Come abbiamo visto i bufali sono animali a fotoperiodo negativo e mostrano un aumento naturale della fertilità in risposta all’incremento del numero di ore di buio. Questo è particolarmente evidente a latitudini più elevate ma si verifica anche nei sub-tropici. Il declino della fertilità indotto dalle ore di luce giornaliera può essere parzialmente superato attraverso le tecniche di riproduzione assistita (ART), compresi i trattamenti per l’induzione dell’ovulazione e l’inseminazione strumentale (IS). L’applicazione di tali tecnologie risulta necessaria in Italia, in quanto consente di evitare un disaccoppiamento della funzionalità riproduttiva dall’anno solare, in una specie che presenta una lunghezza della gestazione di circa 310 giorni ed un lungo periodo di anaestro post-partum. A ciò si aggiunga che in Italia ci sono anche dei “drivers” di mercato da tenere in considerazione, per cui è necessario garantire la produzione annuale di latte.

Nei tropici e nei sub-tropici, le alte temperature e l’umidità durante il periodo estivo si combinano inducendo l’anaestro. Alcune strategie manageriali applicate per mitigare questi fattori di stress, come il raffreddamento attivo, sono necessari per mantenere un buon livello di produttività. Inoltre, durante l’estate, sia la quantità che la qualità degli alimenti è in genere ridotta, il che aggiunge un ulteriore fattore di stress nutrizionale alla funzionalità riproduttiva. Nella situazione Italiana, gli accoppiamenti sono richiesti principalmente nel periodo estivo, in quanto la vendita ed il consumo della mozzarella è principalmente stagionale.

Oltre al fotoperiodo, i fattori esterni che hanno un impatto negativo sulla riproduzione devono necessariamente essere gestiti al fine di realizzare l’opportunità offerta dalla domanda globale di cibo per i prodotti bufalini. Gli approcci includono strategiche integrazioni nutrizionali, l’utilizzo di ART e l’implementazione del management aziendale mediante il miglioramento delle tecniche di allevamento (ad es. raffreddamento per ridurre lo stress da caldo, un’adeguata quantità di spazio, ecc.) che ottimizzano il benessere degli animali in allevamento.

Diversi sono i fattori endogeni che regolano la riproduzione della specie bufalina. Anche se si parla di fattori endogeni, questi sono generalmente influenzati da stimoli esterni. Un tipico esempio è rappresentato dalla prolattina, i cui liveli sono particolarmente elevati durante i periodi caratterizzati da un maggior numero di ore di luce. Bufale che presentano condizioni di “iperprolattinemia” in estate, a causa della lunghezza del giorno e dello stress da caldo, mostrano anche una ridotta secrezione di gonadotropine e vanno facilmente incontro ad anaestro. La conferma del ruolo della prolattina in queste condizioni è suggerita dall’evidenza che bufale sottoposte a sincronizzazione dell’estro trattate con norprolac (in grado di ridurre la prolattina) mostrano una migliore risposta al trattamento.

Tuttavia, va sottolineato che, nonostante quest’evidenza, è stato suggerito che l’ipotiroidismo, con un elevato ormone di rilascio della tireotropina (TRH), può combinarsi con un’elevata prolattina per sopprimere l’attività riproduttiva nella bufala. La comprensione delle interrelazioni tra l’assetto endocrino (prolattina, TRH, ormoni tiroidei), lo stress e l’attività riproduttiva con la stagionalità della bufala richiede ulteriori studi.

I fattori associati al metabolismo e che influiscono sulla funzione gonadica, come l’insulina e l’IGF-1, sono in genere influenzati dall’alimentazione. L’IGF-1 è particolarmente importante nella follicologenesi ovarica, come dimostrato da uno studio nel quale manze bufaline di razza Mediterranea Italiana alimentate con un regime nutrizionale costante hanno mostrato una maggiore concentrazione di IGF-1 follicolare durante il fotoperiodo decrescente rispetto al fotoperiodo crescente. Quindi, in base a questo studio, il fotoperiodo potrebbe influenzare direttamente l’IGF-1 follicolare nel bufalo, sebbene il meccanismo sia ancora sconosciuto.

L’influenza della durata del giorno sullo sviluppo del corpo luteo e la secrezione di progesterone, essenziale per il mantenimento di una gravidanza, è stata ampiamente studiata nella specie bufalina. Durante i periodi caratterizzati da un maggior numero di ore di luce, il corpo luteo è poco vascolarizzato e secerne meno progesterone: in questi periodi infatti, si assiste ad una maggiore incidenza del fenomeno della mortalità embrionale. Inoltre, questi studi sono stati condotti nella razza Mediterranea Italiana in animali mantenuti in regime nutrizionale relativamente costante ed hanno ulteriormente messo in evidenza l’importante ruolo del fotoperiodo nella specie.

Un ruolo fondamentale nella regolazione del fotoperiodo è svolto dalla melatonina, ormone prodotto dalla ghiandola pineale a livello cerebrale, e che rappresenta il principale segnale nella regolazione del ritmo circadiano. Cambiamenti nei pattern stagionali di melatonina impattano sensibilmente sulla funzionalità dei neuroni secernenti il GnRH a livello ipotalamico e, di conseguenza, influenzano la secrezione di gonadotropine e quindi la funzionalità riproduttiva. Una parte della melatonina prodotta a livello cerebrale viene rilasciata nel circolo generale ed agisce a livello periferico. Inoltre, la melatonina è prodotta anche dai tessuti somatici ed i recettori della melatonina (MT1, MT2) sono espressi a livello periferico. È ormai risaputo che la melatonina prodotta localmente può avere azioni autocrine e paracrine nei tessuti somatici, inclusi ovaie e testicoli. Una proprietà importante della melatonina e dei suoi metaboliti è una potente azione antiossidante. In effetti, la melatonina è uno scavenger di radicali liberi dell’ossigeno e dell’azoto più potente rispetto alla vitamina E. Le proprietà antiossidanti della melatonina proteggono le cellule dai danni dei radicali liberi e dai meccanismi apoptotici ed i suoi effetti benefici su sperma, ovociti ed embrioni sono conferiti, almeno in parte, dalla sua azione antiossidante. È stato dimostrato che le bufale acicliche presentano una maggiore concentrazione di radicali liberi dell’ossigeno a livello follicolare e che il trattamento con melatonina riduce lo stress ossidativo d’estate.

La melatonina è presente anche nel plasma seminale e la sua inclusione nel mestruo di congelamento del seme bufalino ha dimostrato un efficace effetto protettivo durante la crioconservazione. Allo stesso modo, la melatonina è risultata idonea a favorire la capacitazione degli spermatozoi bufalini in vitro. Trattamenti a base di melatonina (impianti sottocutanei) in tori bufalini di razza Murrah hanno determinato un miglioramento della qualità del seme sia durante che al di fuori della stagione riproduttiva. Da questi risultati si può concludere che sia la melatonina prodotta a livello testicolare che quella di origine periferica hanno un ruolo nella sopravvivenza e nella funzione degli spermatozoi nel bufalo così come in altri ruminanti: basti pensare che anche il bisonte europeo, un animale stagionale, mostra cambiamenti annuali dei livelli di melatonina testicolare e nei recettori della melatonina e MT1 e MT2. I recettori della melatonina MT1 e MT2 sono espressi nello sperma di allevamenti stagionali e non stagionali [89]. Nelle pecore, la melatonina e i suoi recettori MT1 e MT2 sono espressi dai complessi cumulo-ovociti e dal corpo luteo, ed il recettore MT1 è anche espresso dalle cellule luteali nelle cavalle. Nel bovino, la supplementazione del medium di coltura con melatonina ha incrementato l’espressione dei recettori dell’LH nelle cellule di granulosa coltivate in vitro e, al contempo, ha aumentato gli enzimi steroidogenici e la produzione di progesterone da parte delle cellule della teca ed ha ridotto l’apoptosi. La melatonina ha anche aumentato la steroidogenesi e la produzione di progesterone da parte delle cellule luteali nelle cavalle e nelle scrofe, e simili risultati sono stati osservati anche nella specie bufalina, nella quale si è osservato un aumento della steroidogenesi ed una riduzione dell’apoptosi nelle cellule di granulosa coltivate.

Alcuni studi condotti in vitro, hanno dimostrato che l’integrazione del medium di maturazione con melatonina ha migliorato la maturazione e la fecondazione in vitro degli ovociti di bufalo, maiali e pecore. Inoltre, tornando alle sue proprietà antiossidanti, il fluido follicolare di bufale acicliche ha mostrato una maggiore quantità di radicali liberi dell’ossigeno ed una minore capacità antiossidante rispetto al fluido follicolare delle bufale cicliche. Si può, quindi, ipotizzare che un ulteriore effetto benefico della melatonina sia di neutralizzare i radicali liberi anche nel fluido follicolare. La crioconservazione è stata associata a maggiori quantità di specie reattive dell’ossigeno negli embrioni di Bos indicus rispetto agli embrioni di Bos taurus, suggerendo che l’inclusione della melatonina potrebbe essere potenzialmente utile nelle tecnologie embrionali in vitro, soprattutto nel primo.

La melatonina viene secreta durante l’oscurità in cicli luce-buio di 24 ore. Ciò significa che la durata della secrezione di melatonina è maggiore nei giorni “brevi” rispetto a quelli giorni “lunghi”. Un aumento del periodo di secrezione di melatonina nei periodi caratterizzati da fotoperiodo decrescente ha un effetto positivo sulla funzione riproduttiva nelle specie a giorno breve (ad esempio bufali, cervi, pecore); mentre un ridotto periodo di secrezione di melatonina nei periodi caratterizzati da fotoperiodo crescente ha un effetto positivo sulla funzione riproduttiva nelle specie a giorno lungo (ad esempio criceto, cavallo). Proprio la relazione positiva tra l’aumento della durata dell’esposizione alla melatonina e la stimolazione della funzione riproduttiva nel bufalo ha portato ad una serie di studi che hanno esaminato la capacità del trattamento con melatonina di contrastare il fenomeno dell’anaestro stagionale, soprattutto in soggetti sottoposti a trattamenti di sincronizzazione. Le deduzioni fondamentali che sono state evinte da tali studi sono che un’esposizione alla melatonina prima della sincronizzazione è associata ad una maggiore funzionalità del corpo luteo e ad una maggiore capacità di mantenere una gravidanza nei soggetti in anaestro d’estate. La maggior parte di questi studi sono stati condotti in bufale Murrah in ambiente tropicale, per cui sarebbe interessante condurre studi simili in diversi ambienti ed a latitudini più elevate.

Il gene per il recettore della melatonina MT1 (MTRN1A) è polimorfico ed è stato associato a tratti produttivi e riproduttivi nel bufalo. I polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nel gene MTRN1A sono stati associati ai tassi di concepimento elevati in manze bufaline di razza Murrah trattate con melatonina durante l’estate [120]. Il polimorfismo del gene MTRN1A è stato dimostrato anche nel bufalo Mediterraneo Italiano: in questa razza il polimorfismo è stato associato a differenze nei tassi di concepimento in diverse stagioni e nella capacità di migliorare la fertilità fuori dalla stagione riproduttiva, mentre non è stata rilevata alcuna associazione con la pubertà in manze di razza Mediterranea Italiana. In ogni caso, molti studi sono stati eseguiti sul polimorfismo del gene MTRN1A in bufale di razza Murrah ed ovini di varie razze (Sarda Italiana, Chokla indiana, francesi Merino d’Arles e Dorset). Gli studi sul polimorfismo nel gene MTRN1A presentano l’interessante possibilità di selezionare femmine che possono essere accoppiate in diversi periodi dell’anno per soddisfare le esigenze di produzione e di mercato. Inoltre, alcuni recenti studi di associazione attraverso approccio genome wide e analisi RNA-seq hanno scoperto polimorfismi in altri geni associati alla funzionalità riproduttiva nel bufalo.

Sono degni di nota due aspetti interessanti riguardanti la melatonina nel bufalo, che derivano da alcuni studi condotti nella razza Mediterranea Italiana. Innanzitutto, l’aumento della melatonina durante il buio è meno pronunciato nelle manze rispetto ai soggetti più anziani: questo potrebbe spiegare, almeno in parte, perché gli effetti stagionali sulla riproduzione sono meno evidenti nelle manze. In secondo luogo, le pluripare che mostrano chiari cambiamenti stagionali nella funzione riproduttiva hanno anche un aumento maggiore della melatonina durante i periodi di buio rispetto alle bufale che mostrano cambiamenti stagionali meno pronunciati. Inoltre, tale differenza nei livelli di melatonina durante la notte tra bufali stagionali e meno stagionali è stata osservata durante tutto l’anno e soggetti con melatonina particolarmente alta durante le ore notturne, trasferiti in un allevamento nel quale erano allevati soggetti meno stagionali, hanno conservato le proprie caratteristiche. Da questi studi sembrerebbe che sia la grandezza (sopra una determinata soglia) sia la durata della secrezione di melatonina durante l’oscurità sono coinvolte nella regolazione del fotoperiodo che controlla la riproduzione nella specie bufalina. L’entità dell’aumento della melatonina nell’oscurità molto probabilmente ha una componente genetica e potrebbe essere potenzialmente utilizzata per selezionare soggetti meno sensibili al fotoperiodo.

Conclusioni

In conclusione, l’azione della melatonina per la regolazione del fotoperiodo è ben conosciuta nei ruminanti ed alcuni recenti studi indicano che agisce anche in modo periferico sui tessuti somatici. Un’azione diretta della melatonina sulla funzione ovarica è fortemente supportata dall’espressione dei suoi recettori nei follicoli e nel corpo luteo. I benefici conferiti dalla melatonina nell’accoppiamento fuori stagione e nella risposta alla sincronizzazione dell’estro e all’IS in estate, potrebbero derivare da una combinazione di: effetti antiossidanti sistemici e/o locali, stimolazione della steroidogenesi e/o soppressione dei meccanismi apoptotici. Il potenziale dell’utilizzo del polimorfismo nel gene del recettore della melatonina MTRN1A per selezionare le femmine che mostrano meno sensibilità al fotoperiodo, e sono quindi in grado di riprodursi in maniera ottimale in diversi periodi dell’anno, apre nuovi scenari per la selezione genetica della bufala.

Autori

Gianluca Neglia, Michael J. D’Occhio, Sarvpreet S. Ghuman, Giovanni della Valle, Pietro S. Baruselli, Luigi Zicarelli, José A. Visintin, Mihir Sarkare e Giuseppe Campanile.

 

 

Sinossi di:

D’Occhio MJ, Ghuman SS, Neglia G, Della Valle G, Baruselli PS, Zicarelli L, Visintin JA, Sarkar M, Campanile G. Exogenous and endogenous factors in seasonality of reproduction in buffalo: A review. Theriogenology 2020; 150: 186-192. doi: 10.1016/j.theriogenology.2020.01.044.