S Maria O’Kane,1 L Kirsty Pourshahidi,1 Maria S Mulhern,1 JJ Strain,1 Emer M Mackle,1 Duygu Koca,2 Lutz Schomburg,2 Sarah Hill,3 Jennifer O’Reilly,3 Diana Kmiotek,3 Christian Deitrich,3 Sarah C Bath,4 and Alison J Yeates1
1Nutrition Innovation Centre for Food and Health (NICHE), School of Biomedical Sciences, Ulster University, Coleraine, County Londonderry, Regno Unito; 2Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institute for Experimental Endocrinology, Berlino, Germania; 3LGC, Teddington, Middlesex, Regno Unito; e 4Department of Nutritional Sciences, School of Biosciences and Medicine, University of Surrey, Guildford, Regno Unito 

Abstract

Introduzione

Metodi

Risultati

Discussione

Ringraziamenti

Riferimenti

 

Abstract

Background

Prove recenti hanno evidenziato una prevalenza della carenza, da lieve a moderata, dello iodio in donne in età fertile e in quelle in gravidanza, con notevoli conseguenze sulla salute pubblica dovute all’importante ruolo dello iodio (coinvolto nella produzione degli ormoni tiroidei) durante il neurosviluppo. Il latte vaccino può far incrementare l’assunzione dello iodio in diversi paesi. 

Obiettivo

L’obiettivo di questo studio era quello di analizzare l’effetto dell’aumento del consumo di latte vaccino sui livelli di iodio, sulle concentrazioni degli ormoni tiroidei e sui livelli di selenio. 

Metodi

Uno studio controllato randomizzato di 12 settimane è stato condotto su 78 donne sane (di età compresa tra i 18 e i 45 anni) che consumavano latte in maniera lieve/moderata (< 250 ml/die). Al gruppo di intervento è stato chiesto di consumare 3 litri di latte parzialmente scremato alla settimana, mentre il gruppo di controllo ha continuato a consumare il latte come d’abitudine (media di base: 140 ml/giorno, IQR: 40-240 ml/giorno). Al basale e alle settimane 6 e 12, i partecipanti hanno fornito un campione spot di urina [concentrazione urinaria di iodio (UIC), creatinina] e un campione di sangue raccolto a digiuno (concentrazioni di ormone tiroideo, selenio sierico totale, selenoproteina P). 

Risultati

Al basale, la UIC media (IQR) di tutti i partecipanti era di 78.5 μg/L (39.1-126.1 μg/L). Le variazioni della UIC media basale alla 6a settimana  (35.4 rispetto a 0.6 μg/L, P = 0.014) e alla 12a settimana (51.6 rispetto a -3.8 μg/L, P = 0.045) erano significativamente maggiori nel gruppo di intervento rispetto a quelle nel gruppo di controllo. Nonostante ciò, i cambiamenti relativi al rapporto iodio:creatinina (rispetto al valore basale) non sono risultati significativamente diversi tra i gruppi della 6 a (P = 0.637) o della 12 a settimana (P = 0.178). In nessun momento sono state evidenziate differenze significative nelle concentrazioni di ormone tiroideo o nei livelli di selenio
tra i gruppi.

Conclusioni

Il presente studio mostra come un consumo aggiuntivo di latte vaccino possa far aumentare significativamente la UIC nelle donne in età fertile. Questi risultati suggeriscono che il latte vaccino è una potenziale fonte alimentare di iodio molto importante per questo specifico sottogruppo della popolazione. Questo esperimento è stato registrato su www.clinicaltrials.gov come NCT02767167. J Nutr 2018; 148: 401-408.

Parole chiave: iodio, donne in età fertile, latte vaccino, studio clinico randomizzato controllato, deficienza di iodio, selenio.

Introduzione

Lo iodio è un microelemento essenziale e necessario per la produzione degli ormoni tiroidei triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), fondamentali per la crescita umana e per il neurosviluppo (1, 2). Il selenio è necessario per la conversione del T4 nell’ormone T3 metabolicamente attivo, ed è quindi considerato un co-nutriente nello studio della funzionalità tiroidea (3). Il fabbisogno di iodio aumenta durante la gravidanza, a causa di un aumento del tasso di sintesi degli ormoni tiroidei, della clearance renale e del passaggio di iodio al feto (4, 5). Le conseguenze di una diminuzione del livello di iodio durante la gravidanza possono andare, da un deficit dell’apprendimento (6) ad una diminuzione del quoziente intellettivo (7) in caso di carenza lieve, fino al ritardo mentale irreversibile associato al cretinismo, in caso di carenza grave (8, 9). L’OMS raccomanda pertanto 250 μg di I/die per le donne in gravidanza e in allattamento, e la dose di assunzione di nutrienti di riferimento (RNI) per gli adulti, comprese le donne in età fertile, è di 150 μg di I/giorno (10). La concentrazione di iodio nelle urine (UIC) viene misurata per stabilire il suo consumo in una popolazione, poiché il  ≤ 90% dello iodio alimentare viene escreto con le urine stesse. Nella popolazione in generale una UIC media < 100 μg/L è indicativa di una carenza di iodio (10) e nei soggetti in gravidanza un UIC medio < 150 μg/L ne indica una carenza in questo sottogruppo (10). Garantire che le donne entrino in gravidanza con sufficienti riserve di iodio nella tiroide è una questione molto importante per la salute pubblica. Tuttavia, la carenza di questo microelemento rimane ad oggi una preoccupazione in tutto il mondo e ci sono numerose segnalazioni di insufficienti livelli di iodio (UIC ≤100 μg/L) specie tra le donne in età fertile che vivono in paesi industrializzati, compresi gli Stati Uniti, dove comunque in commercio è disponibile il sale iodato (11-15). Latte e latticini possono contribuire in maniera significativa all’apporto alimentare di iodio totale in Stati Uniti, Danimarca, Norvegia, Regno Unito e Irlanda (16-20), con il latte che contribuisce al 33% delle assunzioni totali nella popolazione adulta del Regno Unito (21). In questo paese, è stato suggerito che il calo generale del consumo di latte potrebbe aver contribuito ad un aumento della comparsa della carenza di iodio, da lieve a moderata, osservata negli ultimi anni (12, 22, 23). Prove ottenute mediante studi osservazionali hanno costantemente dimostrato come il consumo di latte sia associato positivamente con l’assunzione e i livelli di iodio, anche negli Stati Uniti (11, 24-28). Tuttavia, secondo le nostre conoscenze, nessuno studio controllato randomizzato ha ancora esaminato l’effetto del consumo di latte vaccino pastorizzato sui livelli dello iodio. È legittimo ipotizzare la possibilità di favorire l’aumento delle concentrazioni di iodio aumentando il consumo di latte, un alimento economico e ampiamente disponibile, in un sottogruppo della popolazione vulnerabile a questa carenza. L’obiettivo principale di questo studio era quello di indagare l’effetto di un aumento del consumo di latte vaccino sul livello di iodio, misurato dall’UIC. Gli obiettivi secondari erano quelli di valutare l’effetto del consumo di latte sulle concentrazioni di ormone tiroideo e di selenio. 

Metodi

Partecipanti e progettazione dello studio

Lo studio era rappresentato da un trial dietetico controllato randomizzato della durata di 12 settimane condotto su 78 donne sane in età fertile ed eseguito dalla Ulster University, Coleraine, tra il luglio e il dicembre 2015. Il reclutamento riguardava donne di età compresa tra i 18 e i 45 anni, il cui consumo di latte era abitualmente da basso a moderato (consumo di latte ≤ 250 ml/die). I criteri di esclusione riguardavano: fumatori, storia di patologie tiroidee o gastrointestinali, utilizzo di farmaci per la tiroide, intolleranza al lattosio, allergia al latte, non consumatori di latte, dieta vegana e soggetti che avevano assunto integratori alimentari contenenti iodio o selenio nei 3 mesi precedenti lo studio. Ulteriori criteri di esclusione riguardavano le donne incinte, che allattavano al seno o che stavano pianificando una gravidanza durante il periodo dello studio e quelle che erano considerate nel periodo peri- o post-menopausa. Il consenso informato scritto è stato firmato dai partecipanti idonei. Il presente studio è stato condotto secondo le linee guida stabilite nella Declaration of Helsinki e tutte le procedure che coinvolgevano soggetti umani sono state approvate dalla Ulster University Research Ethics Committee (REC/15/0042). Lo studio è stato registrato su clinicaltrials.gov (NCT02767167). La dimensione a priori del campione è stata calcolata utilizzando G*Power (Università di Dusseldorf), versione 3.1 (29), con la UIC come esito primario tra i gruppi. È stato richiesto un campione con dimensione totale di 70 individui per poter rilevare (o meno) un aumento del 30%  della UIC media della popolazione (80.1 μg/L), modificando il livello dello iodio da inadeguato a sufficiente (α = 0.05, β = 0.80; dimensione dell’effetto = 0.30) (26). Un ulteriore 10% è stato aggiunto tenendo conto dell’abbandono dello studio. Un responsabile non legato agli studi clinici ha assegnato, in maniera casuale, i partecipanti idonei o al gruppo di intervento o a quello di controllo utilizzando il software di randomizzazione MINIM (30). La randomizzazione stratificata è stata fatta sulla base del consumo medio di latte basale (inferiore o superiore al consumo medio di 120 ml/die) con un rapporto di allocazione di 1:1 per poter garantire che i gruppi fossero bilanciati rispetto al loro consumo abituale di latte. Ai partecipanti del gruppo di intervento sono stati forniti 3 litri di latte pastorizzato parzialmente scremato alla settimana, ed essi erano tenuti a consumarlo in maniera uniforme durante la settimana (~ 430 ml/giorno) nella maniera da loro più desiderata (ovvero, come bicchiere di latte, frappè o in tè o caffè), continuando, allo stesso tempo, a mantenere le loro consuete abitudini alimentari e il loro stile di vita. Prima dell’analisi del latte utilizzato durante l’intervento, si è ipotizzato che il consumo dei 430 ml di latte/die avrebbe fornito ulteriori 133 μg di I/die (92% del RNI del Regno Unito; 140 μ /die) (31), basandoci su una concentrazione attesa di iodio nel latte pari a 310 μg/L (32). A quelli del gruppo di controllo non è stato fornito latte e gli è stato chiesto di continuare il loro consumo abituale, con le loro abitudini alimentari e con l’usuale stile di vita. Il latte utilizzato nello studio è stato acquistato al dettaglio ed aveva quindi una composizione simile a quella della tipologia consumata abitualmente dai partecipanti prima dell’indagine e dal gruppo di controllo durante tutto il periodo dell’intervento. Ogni partecipante è stato sottoposto ad una visita clinica completa al basale (settimana 0) e alle settimane 6 e 12, quando sono state raccolte le misure antropometriche, i dati sulla dieta, i campioni di urina e di sangue. 

Campioni di sangue ed urina

I partecipanti hanno fornito un campione mattutino non a digiuno di urina da 10 ml alle settimane 0, 6 e 12. I campioni sono stati raccolti in provette sterili prive di conservanti. Sono state prelevate delle aliquote da ogni campione e poi sono stati conservati a -80° C fino all’analisi dei lotti alla fine dello studio. Alle settimane 0, 6 e 12 un operatore esperto ha prelevato anche un campione di sangue da 30 ml dai soggetti a digiuno. I campioni di sangue sono stati processati entro 4 ore dalla raccolta. Le aliquote sieriche sono state ottenute centrifugando sangue intero a 1370 g per 15 minuti a 4°C. Le aliquote preparate sono state conservate a -80°C fino all’analisi dei lotti alla fine dello studio. 

Misurazioni antropometriche

L’altezza (in centimetri) è stata misurata il più vicino possibile (0.1 cm) al basale utilizzando uno stadiometro calibrato (SECA). Il peso (in chilogrammi) è stato misurato, ad ogni punto temporale, con un’approssimazione di 0.1 kg, senza indumenti pesanti o calzature utilizzando bilance calibrate (SECA, Brosch Direct Ltd.). Il BMI è stato calcolato come peso diviso per altezza al quadrato (kg/m2). Tutte le misurazioni sono state fatte dallo stesso ricercatore utilizzando la stessa attrezzatura per tutti i punti temporali. 

Dieta

Per ogni punto temporale, i partecipanti hanno completato un richiamo dietetico delle 24 ore, che è stato analizzato utilizzando Nutritics. I richiami dietetici delle 24 ore sono stati utilizzati per stimare il consumo di latte al fine di valutare la conformità con lo studio d’intervento. 

Misurazioni biochimiche

La UIC è stata misurata in campioni rappresentativi mediante spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente dall’University Hospital di Southampton (7). Il livello di iodio del gruppo è stato classificato secondo i criteri dell’OMS, per i quali un UIC medio  < 100 μg/L indica il rischio di una carenza di iodio (10). Tutti i campioni sono stati misurati in duplice copia e l’accuratezza dei risultati è stata verificata per mezzo di materiale di riferimento certificato (Seronorm Level 1 e Level 2; Sero). La concentrazione di creatinina urinaria è stata misurata anche presso l’University Hospital di Southampton con il metodo di Jaffe (7, 33). Il rapporto iodio:creatinina è stato calcolato per correggere la variazione intra individuale del volume urinario (10, 34, 35). Le concentrazioni sieriche di ormone tiroideo sono state misurate per valutare la funzionalità tiroidea. Le concentrazioni di T3 (FT3), T4 (FT4) liberi e di ormone tireostimolante (TSH) sono state analizzate utilizzando un analizzatore modulare Roche Cobas 8000 (Biochemistry Laboratory, Northern Health e Social Care Trust). I valori di riferimento normali utilizzati erano i seguenti: TSH, 0.27-4.2 mIU/L; FT3, 3.5-6.8 nmol/L; e FT4, 12.0-22.0 pmol/L (36). Due marker della concentrazione di selenio sono stati misurati dalla Charité-Universitätsmedizin di Berlino. Le concentrazioni sieriche di selenio totale sono state misurate mediante fluorescenza a raggi X, utilizzando uno spettrometro a raggi X a riflessione totale (PicofoxS2; Bruker Nano GmbH). Ai fini di questo studio, il livello di selenio era considerato inadeguato quando la sua concentrazione sierica era inferiore ai 70 μg/L (37). Abbiamo anche misurato le concentrazioni sieriche di selenoproteinaP (SELENOP), una misura funzionale del livello di selenio (38), mediante un saggio ELISA a sandwich (Selenotest; ICI GmbH). 

Analisi del latte

Sono stati raccolti e conservati a -20°C dei campioni settimanali (n = 21) del latte fornito al gruppo di intervento fino al momento della loro analisi per valutarne le concentrazioni di iodio e di selenio, da parte di LGC Limited (Teddington, Middlesex, Regno Unito). Per la determinazione del selenio, i campioni sono stati sottoposti a digestione con microonde con acido nitrico (39); per la determinazione dello iodio, i campioni sono stati digeriti con idrossido di tetrametilammonio prima della spedizione a LGC Limited (39). I campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente (Element2; ThermoFisher Scientific), come descritto in precedenza (40). L’incertezza del metodo per l’analisi dello iodio e del selenio è stata calcolata, rispettivamente, come ± 10% e ± 15%, utilizzando l’International Organization for Standardization 17 025. L’accuratezza dei risultati è stata verificata utilizzando materiale di riferimento certificato (ERMBD150; Standard LGC). 

Figura 1. Diagramma di flusso CONSORT che illustra il flusso dei partecipanti durante lo studio d’intervento. CONSORT, Consolidated Standard of Reporting Trials; UIC, concentrazione urinaria di iodio. 

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Analisi statistiche

L’analisi statistica è stata effettuata mediante l’utilizzo di Statistical Package for Social Sciences (SPSS) per Windows (versione 22.0, IBS SPSS Statistics). I risultati raccolti si basavano su analisi intention-to-treat (ultima osservazione riportata). La normalità è stata valutata utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. I dati sulla UIC, sul rapporto iodio:creatinina e sulla SELENOP non erano distribuiti normalmente e pertanto abbiamo riportato le medie e gli IQR. Le differenze tra i gruppi sono state stimate utilizzando test t indipendenti per i dati parametrici o test U Mann-Whitney per i dati non parametrici. Abbiamo utilizzato test Signed-Rank di Wilcoxon per esaminare i cambiamenti all’interno di ciascun gruppo durante lo svolgimento dello studio. Per confrontare la percentuale dei partecipanti con un basso livello di iodio o di selenio (UIC <100 μg/L, selenio < 70 μg/L) tra i gruppi, è stato utilizzato il test esatto di Fisher visto la piccola numerosità di ciascun gruppo. L’ANOVA ad 1 fattore è stata utilizzata per testare le variazioni della concentrazione di iodio e di selenio nei campioni di latte utilizzato durante l’intervento. Le correlazioni per ranghi di Spearman sono state utilizzate per esplorare il rapporto tra il consumo di latte e il livello dello iodio. Un valore P <0.05 è stato considerato significativo ovunque. 

Tabella 1. Caratteristiche di base dei partecipanti allo studio di entrambi i gruppi1 

1I valori sono in media (IQR), n = 78. FT3, triiodotironina libera; FT4, tiroxina libera; SELENOP, selenoproteina P; TSH, ormone tireostimolante; UIC, concentrazione urinaria di iodio. 

2Le differenze, al basale tra i 2 gruppi sono state stimate mediante il test U di Mann.Whitney o da t test indipendenti. 

Risultati

In Figura 1 è delineata una panoramica del reclutamento e del flusso dei partecipanti allo studio, secondo le linee guida di CONSORT (Consolidated Standards of Reporting Trials) (41). Dei 78 partecipanti reclutati, 5 si sono ritirati (n = 2 del gruppo di intervento, n = 3 del gruppo di controllo). L’analisi intention-to-treat è stata condotta su tutti e 78 i partecipanti. Non c’erano differenze in nessuna caratteristica di base tra i partecipanti che si sono ritirati dallo studio e quelli che hanno completato lo studio. Le caratteristiche basali dei partecipanti al gruppo di intervento (n = 39) e a quello di controllo (n = 39) sono mostrate nella Tabella 1. L’età media (IQR) di base dei partecipanti era 26.5 anni (21.8- 33.0 anni). Tra i gruppi di intervento e di controllo non c’erano differenze significative al basale per quanto riguardava qualsiasi caratteristica dei partecipanti, inclusa la UIC (P = 0.393), il rapporto iodio:creatinina (P = 0.842) e il consumo giornaliero di latte (P = 0.539). Utilizzando i dati provenienti dal richiamo dietetico di 24 ore, l’assunzione giornaliera media di latte (IQR) nel gruppo di controllo è stata stimata, alle settimane 0, 6 e 12 rispettivamente, in 140 ml/die (40-240 ml/die), 130 ml/die (80-240 ml/die) e 120 ml/die (80- 225 ml/die). In confronto, il gruppo di intervento ha consumato una stima, alle settimane 0, 6 e 12 rispettivamente,  di 120 ml/die (40-200 ml/die), 340 ml/die (120-425 ml/die) e 260 ml/die (150-420 ml/die). 

Livello dello iodio

La UIC era significativamente più elevata nel gruppo di intervento dopo le settimane 6 e 12 rispetto a quella del gruppo di controllo (P = 0.005 e P = 0.026, rispettivamente) (Tabella 2). Anche le variazioni della UIC (rispetto al basale) alla sesta settimana  (media: 35.4 rispetto a 0.6 μg/L, P = 0.014) e alla dodicesima settimana (51.6 rispetto a -3.8 μg/L, P = 0.045) erano significativamente maggiori nel gruppo di intervento rispetto a quelle del gruppo di controllo. Il rapporto iodio:creatinina tendeva ad essere maggiore nel gruppo di intervento rispetto al gruppo di controllo alla sesta (P = 0.10) e alla dodicesima settimana (P = 0.14), e anche il cambiamento nel rapporto basale-sesta settimana, tendeva ad essere più alto nel gruppo di intervento (36.7 rispetto a -4.0 μg/L, P = 0.061) rispetto al gruppo di controllo. All’interno del gruppo di intervento, sia la UIC che il rapporto iodio:creatinina erano significativamente maggiori, se comparati ai valori basali (UIC, P = 0.007; iodio:creatinina , P = 0.004), tra la sesta e la dodicesima settimana (UIC, P = 0.02; iodio:creatinina, P = 0.01). Tuttavia, non vi erano differenze significative nell’UIC o nel rapporto iodio:creatinina nel gruppo di controllo quando i valori basali sono stati confrontati con quelli della 6a settimana (UIC, P = 0.84, iodio:creatinina, P = 0.94). Quando i valori basali sono stati confrontati con i valori della 12a settimana, non vi era alcuna differenza significativa nell’UIC all’interno del gruppo di controllo (P = 0.49)e, anche se sembrava esserci un aumento del rapporto iodio:creatinina, questo alla fine non è risultato significativo (P = 0.11). Di base, il 62% dei partecipanti appartenenti al gruppo di intervento avevano una UIC < 100 μg/L, che si è ridotto significativamente ad un 38% dopo l’intervento (P = 0.042). Nel gruppo di controllo non è stato osservato alcun cambiamento significativo nella proporzione dei partecipanti aventi una UIC <100 μg/L, tra il valore basale (62%) e quello raccolto alla dodicesima settimana (61%) (P = 0.838). Per tutti i partecipanti, il consumo di latte riportato è stato associato, in maniera positiva e significativa, con il rapporto iodio:creatinina basale (ρ = 0.27, P = 0.018) e in maniera non significativa, con la UIC (ρ = 0.19, P = 0.09). Dopo l’intervento, l’associazione positiva tra il rapporto iodio:creatinina e il consumo di latte, è rimasta significativa nel gruppo di intervento (ρ = 0.464, P = 0.004) ma non nel gruppo di controllo (ρ = 0.311, P = 0.06). Di base, quei partecipanti che avevano un consumo di latte considerato sopra la media (> 120 ml/die), avevano uno rapporto iodio:creatinina significativamente più alto nelle urine [media (IQR): 91.4 μg/g (67.2-117 μg/g) rispetto a 70.4 μg/g (54.7-110 μg/g); P = 0.04], e nessuna associazione con la UIC [72.2 μg/g (29.6-111 μg/g) rispetto a 91.8 μg/g (39.6-149 μg/g); P = 0.184], rispetto a quei soggetti che consumavano un quantitativo inferiore di latte ( ≤ 120 ml/die). Il consumo di latte segnalato nel gruppo di intervento alla settimana 6 e alla settimana 12 era, rispettivamente, di 340 e 260 ml/die, ma non vi era alcuna differenza significativa tra i 2 punti temporali (P = 0.791). 

Ormoni tiroidei e livello del selenio

Di base, il 97% (n = 76), il 100% e il 96% (n = 75) dei partecipanti aveva concentrazioni di TSH, FT4 e FT3 entro il range della normalità. L’intervento con il latte non ha avuto alcun effetto sulle variazioni dell’ormone tiroideo, senza differenze significative tra i gruppi (rilevate alla dodicesima settimana) per quanto riguardava il TSH (P = 0.478), l’FT3 (P = 0.938) o l’FT4 (P = 0.921) (Tabella 2). Né è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra i gruppi per quanto concerne la concentrazione di selenio sierico (P = 0.934) o di SELENOP (P = 0.540), sempre valutati alla dodicesima settimana (Tabella 3). La concentrazione media di selenio sierico in tutti i gruppi era, al basale, di 77.9 μg/L e il 27% (n = 21) dei partecipanti presentava uno livello di selenio inadeguato (< 70 μg/L). Di questi partecipanti, il 17% aveva anche una UIC < 100 μg/L. Non sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi per quanto concerne la proporzione dei partecipanti con un basso (< 70 μg/L) livello di selenio sierico al basale (P = 0.31) o al termine dello studio (P = 0.80). 

Composizione in iodio e selenio del latte

La concentrazione media (IQR) di iodio nel latte usato durante l’intervento era di 746 μg/L (715-790 μg/L) e la concentrazione media (IQR) di selenio era di 19.9 μg/L (18.6-21.1 μg/L) . Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nelle concentrazioni di iodio (P = 0.15) o di selenio nel latte usato nell’intervento durante il mese di raccolta (P = 0.22) (Tabella supplementare 1). 

Tabella 2. Livello dello iodio basale, alla 6a e alla 12a settimana1, nei partecipanti allo studio. 

1I valori sono in media (IQR), n = 78. *Diversi al basale, P < 0.05. FT3, triiodotironina libera; FT4, tiroxina libera; TSH, ormone tireostimolante; UIC, concentrazione urinaria di iodio. 

2Le differenze tra i gruppi ad ogni punto temporale, sono state stimate mediante il test U di Mann.Whitney o da t test indipendenti.

Tabella3. Livello di selenio basale e alla 6e alla 12asettimana