Il bufalo (Bubalus bubalis), noto anche come bufalo d’acqua, è un animale domestico di importanza mondiale e di immenso valore per l’uomo, fornendo latte, carne e forza lavoro. La popolazione mondiale stimata è di oltre 200 milioni di capi distribuiti principalmente in India e Pakistan (oltre 97% della popolazione totale). Esistono due sottospecie del bufalo d’acqua domestico: il bufalo di palude (Bubalus bubalis carabanesis, 2 N = 48) e quello di fiume (Bubalus bubalis bubalis, 2 N = 50). La distribuzione dei bufali di palude si sovrappone strettamente a quella dell’agricoltura del riso nei paesi dell’Asia orientale e sudorientale (ad es. Cina, Vietnam e Thailandia), dove questi sono utilizzati come animali da lavoro per la coltivazione del riso da migliaia di anni. I bufali sono erbivori e la maggior parte della loro dieta è composta da fibra vegetale come le erbe da foraggio. Possiedono il caratteristico apparato prestomacale dei ruminanti, però altamente specializzato per trasformare foraggio di basso valore nutritivo in proteine di origine animale di elevata qualità. La digeribilità della materia organica è maggiore nei bufali e massima quando gli animali vengono nutriti con fieno.
L’importanza del microbiota di diversi siti nel tratto digerente è ormai ben riconosciuta ed è stata collegata alle funzioni ed alla fisiologia dei corrispondenti siti tratti. Per ad esempio, il rumine, la prima e più importante sede dello stomaco ruminanti, contiene un gran numero di batteri in grado di digerire la cellulosa (il componente principale delle pareti cellulari delle piante), compresi batteri delle famiglie Fibrobacter, Ruminococcus e Butyrivibrio. Allo stesso modo, Prevotella, un gruppo di batteri in grado di degradare fibre vegetali non cellulosiche, si ritrova in quantità abbondante nel rumine.
A livello ruminale si ritrovano anche gli Archea, che sono riconosciuti tra i principali produttori di metano, uno dei principali gas serra e che sono tra gli obiettivi di riduzione. Oltre ai loro ruoli nella digestione degli alimenti e nell’assorbimento dei nutrienti, il rumine e il microbiota intestinale sono stati collegati a fenotipi più evidenti, come la produzione e la qualità del latte nei bovini. Ad oggi, la ricerca sull‘ecologia microbica nel tratto digestivo dei ruminanti si è concentrata principalmente sul rumine, insieme ad alcuni studi sull’intestino/feci, mentre altri siti sono stati in gran parte trascurati, nonostante diverse prove e studi condotti lascino intendere un ruolo importante nella digestione degli alimenti. Ad esempio, negli esseri umani, il microbiota intestinale è stato collegato a molti aspetti della vita umana, tra cui la salute e le malattie, lo sviluppo, le risposte a farmaci e trattamenti. Inoltre, studi recenti condotti nella specie bufalina hanno utilizzato la tecnica del sequenziamento genico attraverso il gene 16 S rRNA.
Uno degli approcci più moderni per lo studio delle comunità microbiche è quello metagenomico. La metagenomica può essere definita come lo studio delle sequenze di DNA, per un totale di almeno 100 milioni di coppie di basi da campioni ambientali (che pertanto comprendono il DNA di diversi microrganismi). È la tecnica di elezione utilizzabile per studiare a pieno i rapporti tra i diversi microrganismi all’interno di una comunità microbica, soprattutto quando qualcuno di questi non può essere fatto crescere in laboratorio. Attraverso l’approccio metagenomico è possibile quindi ottenere il sequenziamento del genoma intero su un intero collettivo di microrganismi (il microbioma) e rivelare relazioni inestimabili tra questo e il suo ambiente. L’applicazione delle tecniche di sequenziamento genico di nuova generazione (metagenomic next-generation sequencing – NGS) ha largamente facilitato la ricostruzione di un gran numero di genomi associati al metagenoma (MAGs) in diversi organismi animali, tra cui bovini, capre, maiali, topi e polli, e ha rivelato l’associazione con la salute dell’ospite e alcune malattie. Nel caso del bufalo, la metagenomica dell’intero genoma è stata applicata solo a pochi campioni e solo in alcuni tratti del tratto digestivo.
In questo studio, alcuni autori hanno eseguito un’indagine completa sull’ecologia microbica del tratto digestivo del bufalo. Sono stati raccolti in totale 695 campioni da otto siti del tratto digerente in tre sezioni: i quattro prestomaci (211), l’intestino (85) e il retto (399). Tutti i campioni sono stati sottoposti al sequenziamento metagenomico attraverso approccio NGS e i dati sono stati ripuliti, eliminando le sequenze di DNA contaminanti (derivanti dall’ospite o dagli alimenti), ottenendo alla fine un totale di circa 11 TB di dati da utilizzare per successive analisi. In media sono stati conseguiti 41.842.231 paia di “letture pulite” e 6.244.074.222 basi per ciascun campione e attraverso un approccio bioinformatico si sono ottenuti 4.960 MAGs a livello di ceppo e 3.255 MAGs a livello di specie, rappresentanti in totale l’85% delle letture del sequenziamento grezzo ed indicando probabilmente la presenza di nuove specie e ceppi, in particolare nel tratto intestinale. Infatti, i campioni prelevati a livello dei prestomaci hanno mostrato tassi di mappatura inferiori rispetto a quelli prelevati in intestino e retto. In ogni caso, il tasso di mappatura dei prestomaci bufalini è risultato simile a quello bovino riportato in letteratura, suggerendo che le due specie abbiano un metagenoma simile.
Attraverso un database per la valutazione tassonomica del genoma (Genome Taxonomy Database Toolkit – GTDB-TK) è stata quindi effettuata anche l’analisi tassonomica. Quasi tutti i MAGs sono stati classificati in categorie tassonomiche note ai livelli superiori, come il regno, il phylum, la classe e i livelli di ordine. Tuttavia, a livelli più raffinati, in particolare a livello di specie, solo 460 (9,3%) dei MAGs a livello di ceppo e 415 (12,7%) a livello di specie sono stati classificati come specie conosciute, indicando che la maggior parte dei MAGs erano nuovi (cioè non presenti in GTDB-TK). Batteri e archaea hanno mostrato risultati di classificazione simili tra i MAG a livello di ceppo e specie. I phyla dominanti in base al numero dei MAGs che sono stati assegnati, sono stati Bacteroidota (n = 2.200) e Firmicutes A (n = 1.736) (dominato dalle classi Bacteroidia and Clostridia), seguito da Verrucomicobiota (n = 191), Firmicutes (n = 172), Spirochaetota (n = 164) e Proteobacteria (n = 147). Gli ordini dominanti includevano Bacteroidales (n = 2.194) e Oscillospirales (n = 1.101), mentre le famiglie dominanti sono state Bacteroidaceae (n = 676), CAG-272 (n = 588), Rikenellaceae (n = 483), e UBA932 (n = 368). A livello di genere, i gruppi dominanti sono stati Alistipes, RC9, e Prevotella. Sono state identificate 74 sequenze MAGs realtive agli archea appartenenti a 3 phila: Halobacterota (n = 42), Thermoplasmatota (n = 20), e Euryarchaeota (n = 12), nelle quali i 3 generi più rappresentativi sono stati Methanocorpusculum (n = 27), Methanomicrobium (n = 13) e Methanobrevibacter_A (n = 11). Va sottolineato che tutti questi sono metanogeni.
Valutando la localizzazione delle sequenze individuate nelle 3 porzioni del tratto digerente campionate, si è osservato che 3.032, 3.081 e 4.141 MAGs erano presenti in almeno uno dei campioni delle 3 sezioni. Inoltre, 1692 (34%) MAGs erano presenti in tutte e 3 le sezioni, 1910 (38,5%) in due sezioni e solo una piccola proporzione era specifica di una sezione (499 nei prestomaci e 859 nel retto, mentre non sono state individuate sequenze specifiche dell’intestino). A livello di Philum, 5 phila sono risultati specifici dei prestomaci, tra i quali 3 (UBP3, UBP6, e Eremiobacterota) sono stati individuati come phyla sconosciuti. Gli altri 2 phila, il philum Euryarchaeota è costituito da specie relative al metabolismo del metano, mentre il phylum Synergistota è formato da ceppi batterici identificati per la prima volta nel rumine di capra e associati alla degradazione di composti tossici. A livello del retto il phylum principale è stato Verrucomicrobiota, le cui specie hanno carattere ubiquitario e si ritrovano in terreno, acqua e feci. L’analisi PCA (principal coordinates analysis), effettuata per valutare le differenze tra i campioni dei diversi tratti, ha messo in evidenza un profilo micorbico simile in retto ed intestino, mentre entrambi sono risultati molto differenti dal profilo microbico dei prestomaci. Inoltre, i campioni prelevati a livello del digiuno del tratto intestinale hanno mostrato una grande similarità tra loro e hanno clusterizzato separatamente rispetto a tutti gli altri campioni delle altre porzioni del tubo digerente.
Come accennato in precedenza, i phila Firmicutes e Bacteroidota sono stati quelli più abbondanti nei 3 tratti. Tuttavia, è interessante notare che mentre Bacteroidota ha mostrato una diminuzione lungo il tubo digerente, essendo più presente nei prestomaci e progressivamente meno in intestino e nel retto, Firmicutes ha mostrato un trend opposto. Di conseguenza, il rapporto Firmicutes/Bacteroidota (F/B) è stato più basso a livello dei prestomaci e più alto nel retto. Alcuni studi condotti recentemente hanno associato un incrementato rapporto F/B ad una maggiore capacità di utilizzo dell’energia della dieta. Inoltre, nella vacca da latte il rapporto F/B nel rumine è stato associato al grasso del latte.
La diminuzione di Bacteroidota lungo il tratto digestivo era parzialmente dovuta ad un minor conteggio di Prevotella, il genere principale di Bacteroidota, particolarmente abbondante nei prestomaci ed in particolare nel rumine, mentre il suo numero è risultato significativamente inferiore nelle altre sezioni del tratto digestivo. Questo genere rappresenta il 33,1% della popolazione microbica totale nel rumine. Le specie Prevotella sono associate alla degradazione della fibra di piante non cellulosiche e sono il più grande singolo gruppo batterico descritto a livello ruminale di bovini ed ovini sottoposti alla maggior parte dei regimi alimentari. Sebbene la maggior parte delle specie appartenenti a Prevotella non sia stata ancora classificata, queste svolgono un ruolo fondamentale sia nella degradazione dei nutrienti che nel prevenire l’acidosi ruminale.
La cellulosa è il componente principale della parete cellulare delle piante e la sua degradazione da parte dei microbi associati al tratto digestivo è cruciale nel bufalo come negli altri ruminanti. Fibrobacter, Ruminococcus e Butyrivibrio sono considerati i principali microbi responsabili della degradazione della cellulosa (i substrati di Buyrivibrio sono diversi, tra cui cellulosa, emicellulosa e proteine). Pertanto, è ovviamente molto utile la valutazione della sua distribuzione lungo il tubo digerente.
Come previsto, Fibrobacter spp. (inclusi Fibrobacter e Fibrobacter A secondo GTDB), Ruminococcus spp (incluso Ruminococcus E, Ruminococcus A e Ruminococcus secondo GTDB), e Butyrivibrio all (inclusi Butyrivibrio A e Butyrivibrio secondo GTDB) sono risultati tutti significativamente abbondanti nei prestomaci e meno abbondanti nelle altre porzioni. Tra questi taxa, Fibrobacter spp è stato quello più abbondante. In particolare, il numero totale di Fibrobacter spp è stato significativamente più alto in tutti e quattro i prestomaci (rumine, reticolo, omaso e abomaso), rispetto agli altri due tratti del tratto digerente. Tuttavia, una maggiore presenza di Fibrobacter spp è stata riscontrata a livello omasale, piuttosto che a livello ruminale (dove si è sempre ipotizzato fosse localizzata la maggiore presenza di questo gruppo): Ciò confermerebbe l’ipotesi che l’omaso svolga un ruolo importante nella digestione della cellulosa.
Tutte le specie di Archea identificate erano metanogene, e sono risultate molto abbondanti nei prestomaci e nell’intestino. Questo risultato, in particolare, è risultato abbastanza sorprendente e ha messo in discussione l’attuale letteratura, per la quale sono solo i prestomaci, ed il rumine in particolare, gli organi principali deputati al metabolismo del metano, evidenziando in tal senso l’importanza dell’intestino nel metabolismo di questo gas. Sorprendentemente, un attento esame ha rivelato che l’abbondanza totale di questi metanogeni ha presentato il picco nell’omaso, in coincidenza con Fibrobacter spp. È interessante notare che Archaea e Fibrobacter spp hanno mostrato correlazioni significative nel loro complesso ed una particolare abbondanza sia nei prestomaci che nell’intestino. Inoltre, l’analisi del coefficiente di correlazione tra tutte le popolazioni batteriche e gli Archea ha messo in evidenza come Fibrobacter spp abbia mostrato “l’ecoefficienza” di correlazione più alta con i metanogeni. Da questi risultati è possibile concludere che Fibrobacter spp può svolgere ruoli importanti nella produzione di metano. Studi precedenti hanno dimostrato che i metanogeni nel rumine potenzialmente influiscono sul metabolismo dei batteri che degradano la cellulosa utilizzando l’idrogeno: i risultati ottenuti in questo studio, suggeriscono che tali batteri svolgano ruoli simili nell’omaso. Pertanto, l’omaso potrebbe avere un ruolo sia nel metabolismo del metano, che nella degradazione della cellulosa, con un possibile collegamento funzionale tra i due processi.
È stata inoltre effettuata un’analisi proteomica dei contenuti del metagenoma bufalino e della funzione putativa. Un totale di 9.470.238 proteine sono state predette, basate su 4.960 MAGs. Comparando le sequenze aminoacidiche con specifici database (eggNOG e CAZy), è stato possibile annotare un totale di 4.787.680 (81,7% del totale). Solo una piccola parte delle proteine (114.989; 1,96% sul totale) sono state annotate come enzimi, tra cui la maggior parte, come glicoside idrolasi (GH, 76.224, 66,29% su 114.989), glicosiltransferasi (GT, 21.402, 18,61%) e proteine di legame dei carboidrati (CBM, 11.645, 10,13%). Le rimanenti categorie, presenti in concentrazioni molto più basse, includevano le esterasi dei carboidrati (CE, 3804, 3,31%), le liasi polisaccaridiche (PL, 1879, 1,63%) e le attività ausiliarie previste (AA, 35; 0,03%). Nel complesso, le proteine annotate hanno mostrato identità di sequenza decenti rispetto alle proteine nel database CAZy, con un’identità media del 59,11%. Tuttavia, solo una piccola percentuale (3,8% sul totale delle proteine annotate) ha mostrato identità superiori al 90%, indicando una scarsa rappresentazione dei MAG identificati nei database pubblici disponibili.
È stata quindi calcolata l’abbondanza relativa di tutte le proteine in ciascun campione e confrontate le distribuzioni. Le famiglie CAZy hanno mostrato differenze significative in termini di abbondanze relative (la somma dell’abbondanza di tutte le proteine è stata del 100%) tra le tre sezioni del tratto digestivo. È interessante notare che tutte le famiglie proteiche CAZy, ad eccezione della famiglia dell’attività ausiliaria (AA), hanno mostrato maggiore abbondanze nei prestomaci, seguiti dal retto ed infine l’intestino, sostenendo il ruolo centrale dei prestomaci nella digestione e nella lavorazione del cibo. La maggiore presenza delle famiglie proteiche del database CAZy è stata registrata a livello ruminale, ad eccezione delle proteine di legame dei carboidrati (CBM), la cui maggiore presenza è stata a livello omasale. Anche in questo caso, il digiuno è stato identificato come un sito anomalo che conteneva le percentuali più basse di tutti e sei le famiglie CAZy, probabilmente a causa della scarsa diversità microbica
Interessanti risultati, infine, sono emersi dal confronto del microbiota ruminale tra bufali e bovini. Il rumine è spesso considerato il più importante stomaco prestomaco dei ruminanti. È la prima sezione del tratto digestivo ed anche il prestomaco con la maggiore volumetria. A questo livello vengono inizialmente degradati gli alimenti e rappresenta il principale sito di produzione del metano. Il microbiota del rumine gioca un ruolo importante nel suo funzionamento ed è stato il primo microbiota dei prestomaci studiato dai ricercatori. Sono quindi state confrontate sia la tassonomia che i profili funzionali del microbiota ruminale di bufalo con quelli di bovino, recentemente messo a disposizione in un altro studio (Stewart et al. Compendium of 4,941 rumen metagenome-assembled genomes for rumen microbiome biology and enzyme discovery. Nat. Biotechnol. 2019;37: 953–961). In questo caso, bufalo e bovino hanno mostrato significative differenze nei due phila più abbondanti (Firmcutes spp e Bacteriodoita) e, di conseguenza, nei loro rapporti.
Le specie del philum Bacteroidota, in particolare quelle dominanti nel genere del phylum, Prevotella, possono utilizzare lattato e sono in grado di degradare le fibre vegetali non cellulosiche. Quindi, la maggiore abbondanza di Bacteroidota, Prevotella e Butyrivibrio tutti identificati nel rumine di bufalo rispetto a quello di bovino, così come i livelli simili di Fibrobacter spp (responsabile della digestione cellulosolitica delle fibre vegetali), confermano che la specie bufalina è più adattata alla digestione del foraggio grossolano rispetto al bovino. Al contrario, sono stati riscontrati livelli significativamente più elevati di Archaea e Ruminococcus spp nei bovini, e tutte queste specie svolgono un ruolo importante nella metanogenesi attraverso la bioidrogenazione e la glicolisi: questi risultati suggeriscono che il bufalo sia in grado di produrre molto meno metano rispetto al bovino. Sono state anche confrontate le famiglie di proteine ruminali (CAZy) tra bufali e bovini. Sorprendentemente, tutti e sei le famiglie erano significativamente più abbondanti nei bufali. Questo risultato suggerisce ulteriormente che il bufalo possegga una maggiore capacità metabolica di utilizzo dei carboidrati rispetto ai bovini.
A cura di Alessio Cotticelli, Roberta Matera & Gianluca Neglia
