La ricerca analizza il ruolo di citochine e cellule immunitarie nella comunicazione tra l’embrione e l’utero nei bovini, e per la riuscita della gravidanza.
Introduzione
Nei bovini, la mortalità embrionale tra la fecondazione (creazione dello zigote) e il 45° giorno di gestazione, rappresenta la principale causa di fallimento riproduttivo (Khalib e Gross, 2019; D’Occhio et al., 2020; Reese et al., 2020). Le percentuali di avvenuta fecondazione nei bovini (sia da latte che da carne) sono nell’ordine dell’85-95%; tuttavia, il 40-50% degli embrioni non esita in una gravidanza a termine (Rubio et al., 2005; D’Occhio et al., 2020). La maggior parte della perdita embrionale si verifica in tre finestre temporali: tra il primo ed il settimo giorno (25-30%), tra l’ottavo ed il quattordicesimo giorno (10-20%) e tra il quindicesimo ed il ventunesimo giorno (5-10%) (Thatcher et al., 2001; Ealy et al., 2019; Figura 1).
Figura 1. Sviluppo embrionale precoce e perdita embrionale nella specie bovina. Il colore rosso nei grafici a torta nel pannello superiore rappresenta la percentuale di perdita embrionale nelle diverse fasi.
Numerosi fattori intervengono nell’eziopatogenesi della mortalità embrionale ma, soprattutto nella bovina da latte, essa può dipendere dalle alte produzioni (Geary et al., 2016). Gli embrioni prodotti in vitro hanno una probabilità di andare incontro a mortalità embrionale nell’ordine del 60-70% (Rubio et al., 2005; Ealy et al., 2019). Ad oggi, abbiamo numerose conoscenze relative alla mortalità embrionale, ma ancora poco si è fatto praticamente per evitare o quantomeno ridurre questo fenomeno. Ci sono stati alcuni miglioramenti per produrre e valutare embrioni sia in vivo che in vitro, ma tutto ciò ha solo lievemente migliorato l’efficienza riproduttiva nella specie (Ramos-Ibeas et al., 2019; Vailes et al., 2019).
L’elevata perdita embrionale non è caratteristica solo dei bovini, si verifica anche in altri importanti animali di interesse zootecnico, quali bufale (Campanile e Neglia, 2007), capre (Wang et al., 2016), maiali (Pope e First, 1985) e pecore (Bolet, 1986). L’incapacità di rendere significativi i progressi ottenuti nel migliorare la sopravvivenza embrionale può essere spiegata con un’insufficiente conoscenza degli eventi cellulari e molecolari durante il periodo del preimpianto (Artus et al., 2020). Recenti reviews sullo sviluppo, sull’adesione e sull’impianto embrionale hanno dimostrato il ruolo delle molecole di adesione cellula-cellula (van Mourik et al., 2009), dell’interferone tau (IFN-τ) (Lonergan et al., 2019; Bazer et al., 2020), della kisspeptina (D’Occhio et al., 2020) e degli esosomi/vescicole extracellulari (Nakamura et al., 2020; Mitchell et al., 2020). È evidente che una continua comunicazione tra il prodotto del concepimento e l’utero è fondamentale per l’impianto ed il mantenimento della futura gravidanza (Mamo et al., 2012; Sanchez et al., 2019). Il successo o il fallimento di questa comunicazione è dovuto alla presenza e al lavoro di alcuni importanti ormoni, quali estrogeni e progesterone (Pohler et al., 2012; Bages-Arnal et al., 2020). Quest’ultimo si basa su un corpo luteo attivo, vascolarizzato e funzionante (Bazer et al., 2008). L’innesco tra estrogeni e progesterone prepara l’utero a rispondere ai segnali emanati dall’embrione, consentendogli anche di iniziare un dialogo reciproco (Bazer et al., 2014).
Nei bovini, le comunicazioni tra l’ovidotto e l’embrione iniziano già dal 3-4° giorno di vita embrionale, quando quest’ultimo è ancora nell’ovidotto (Kölle et al., 2020), iniziando a produrre IFN-τ (Talukder et al., 2018) e aumentandone la produzione a partire dai giorni 7-8 (D’Occhio et al., 2020). L’IFN-τ è un interferone di tipo I (della famiglia delle citochine) che avvia una sequenza di eventi a livello uterino (Roberts, 2007; Mathew et al., 2019) in maniera sistemica (Ott e Gifford, 2010), associati con il riconoscimento materno della gravidanza. L’IFN-τ impedisce il rigetto del prodotto del concepimento (animali da allevamento, Ott, 2019 e 2020; esseri umani, Yoshinaga, 2012 e Zenclussen 2013), inoltre, facilita l’adesione dell’embrione all’epitelio endometriale uterino per iniziare l’impianto (D’Occhio et al., 2020). La modulazione della risposta immunitaria materna al concepimento è particolarmente importante nel riconoscimento materno della gravidanza (Schumacher et al., 2018 e 2019). Come notato da Khatib e Gross (2019) l’utero ha una notevole plasticità da un punto di vista genico ed i segnali emanati dall’embrione possono avere un impatto importante sull’espressione di geni immuno-correlati a livello uterino. È probabile che il grado di modulazione immunitaria materna durante l’impianto differisca per le specie con placentazione invasiva (umani, roditori; Pollheimer et al., 2018; Robertson et al., 2018) rispetto alle specie con placentazioni meno invasive (ruminanti, maiali; Komi et al., 2020; Massimiami et al., 2020). I bovini sono riconosciuti come specie di “impianto tardivo” ed il prodotto del concepimento si muove all’interno dell’utero e subisce un notevole allungamento durante il periodo preimpianto (Peippo et al., 2011; Peter et al., 2017). Ciò contrasta con l’”impianto precoce” in specie come umani e roditori. L’allungamento del trofoblasto nei bovini garantisce il massimo contatto con l’endometrio, ed in particolare con le caruncole che formano la placenta diffusa (Peter, 2013; Haeger et al., 2019). Quindi, nei bovini, la comunicazione tra il prodotto del concepimento e l’utero avviene per un periodo prolungato prima dell’impianto e si può presumere che questo includa un dialogo immunitario. Questo potrebbe rendere l’immunologia dello sviluppo iniziale dell’embrione e l’impianto embrionale nei bovini particolarmente importante. È evidente che i processi immunitari prima e durante l’impianto sono parte integrante del successo della gravidanza (Moffett e Loke, 2006; Croy et al., 2009). L’attenzione si concentra sulle citochine e sulle cellule immunitarie all’interno dell’ovidotto e dell’utero, durante il periodo critico dalla fecondazione all’adesione del trofoblasto all’epitelio uterino. Una più profonda comprensione delle caratteristiche molecolari e cellulari durante la prima fase di sviluppo dell’embrione e dell’impianto/placentazione è necessaria prima di poter effettuare un miglioramento nell’efficienza aziendale.
Il termine “embriochine” è stato utilizzato per descrivere la miscela di chemochine, citochine e fattori di crescita secreti dall’ovidotto e dall’utero durante l’iniziale sviluppo dell’embrione e le fasi di impianto (Tribulo et al., 2017, 2018). Il termine è corretto solo in parte in quanto fattori prodotti dall’utero hanno un impatto non solo sull’embrione ma anche sull’utero stesso. Le citochine hanno un ruolo fondamentale nella regolazione dell’equilibrio tra le azioni pro infiammatorie e anti infiammatorie che preparano l’utero per l’impianto. Le citochine sono un gruppo molto ampio di molecole di segnalamento che comprendono: interleuchine, interferoni, chemochine, fattori stimolanti le colonie, fattori di crescita mesenchimali e fattori di necrosi tumorale (Dinarello, 2007; Turner et al., 2014). Le citochine si dividono in classi funzionali che includono: fattori di crescita dei linfociti, molecole pro e antinfiammatorie e citochine che dirigono la risposta immunitaria verso gli antigeni. Le citochine IL-6 e LIF sono specificatamente menzionate in quanto si è successivamente dimostrato che hanno un ruolo importante anche nella sfera riproduttiva (Kimber, 2015; Seshagiri et al., 2016). Il ruolo fondamentale della citochina IFN-τ all’inizio dello sviluppo e dell’impianto embrionale è stato ampiamente discusso (Imakawa et al., 2018; Velazquez et al., 2019). Si potrebbe sostenere che le citochine IL-6 e LIF hanno ruoli minori rispetto a IFN-τ; tuttavia, IL-6 e LIF sono ancora molto importanti per il normale sviluppo embrionale e la gravidanza. Le citochine influenzano quasi tutti i tipi di cellule, sono definite pleiotropiche e una singola citochina può influenzare l’attività di molte cellule aventi funzioni diverse (Dinarello, 2007). Le citochine sono state considerate analoghe agli “ormoni” (Dinarello, 2007). Tuttavia, è importante distinguere ormoni classici e citochine: i primi agiscono su cellule e tessuti bersaglio specifici, le seconde invece su cellule e tessuti diversi. In particolare, la famiglia dell’interleuchina-6 (IL-6), in particolare, è coinvolta nelle prime fasi sviluppo e impianto (Chaouat et al., 2007; Sharma et al., 2016; Figura 2).
Figura 2. Rappresentazione schematica della comunicazione citochinica tra l’embrione e l’utero durante lo sviluppo embrionale precoce, l’attaccamento e l’impianto, nei mammiferi. La sequenza temporale utilizzata è quella tipica della specie bovina. L’ovidotto avvia la diafonia secernendo IL-6 che, in parte, stimola l’embrione primitivo a rilasciare IFN-τ. Il prodotto del concepimento cresce e si sviluppa per formare il trofoblasto che secerne ulteriormente IL-6, IL-11 e LIF. Durante questo periodo l’epitelio e l’endometrio uterino rilasciano anche loro IL-6 e LIF. L’attaccamento del trofoblasto all’epitelio uterino si basa su un equilibrio tra l’attività pro-infiammatoria e antinfiammatoria all’interno dell’utero. Questo l’equilibrio è fornito dalle quantità relative di IFN-τ e IL-11 (antinfiammatorio) e IL-6 e LIF (pro-infiammatorio). INF-τ, interferone-tau; IL-6, interleuchina-6; I L- 11, interleuchina-11; LIF, fattore inibitorio della leucemia.
L’azione di IL-6 nella regolazione dell’infiammazione è particolarmente rilevante per i cambiamenti nell’utero in congiunzione con l’adesione e impianto del trofoblasto (Prins et al., 2012). La biodisponibilità di IL-6 all’inizio della gestazione è finemente bilanciata per garantire che l’infiammazione uterina sia un evento controllato con precisione e legato al tempo (Prins et al., 2012). La fonte di IL-6 durante i primi momenti della gravidanza è data dall’endometrio uterino e dai macrofagi presenti a livello uterino (Diehl e Rincón, 2002; Yoo et al., 2017). L’espressione di IL-6 è stata dimostrata anche nell’allungamento embrionale negli ovini e nei bovini (Mathialagan et al., 1992). Attualmente si ritiene che la comunicazione tra il trofoblasto e l’epitelio/endometrio uterino, mediata da IL-6, è un processo necessario durante l’adesione e l’impianto del futuro embrione (Dubinsky et al., 2010). L’azione dell’IL-6 è stata anche studiata in vitro, in numerose specie. Si è visto che l’IL-6 ha aumentato il numero di cellule dell’inner cell mass negli embrioni bovini (Wooldridge et al., 2019a, b) e ha facilitato lo sviluppo di embrioni partenogenetici suini (Shen et al., 2012).
Le citochine del plasma seminale e/o del seme intervengono nella risposta infiammatoria uterina durante l’accoppiamento nella specie bovina (Mattner, 1968; Katila, 2012). C’è un rinnovato interesse in quest’area, in linea con i tentativi di aumentare l’efficienza riproduttiva nei bovini (Bromfield, 2016; Akthar et al., 2020). Il plasma seminale bovino contiene citochine (IL-6, IL-10) che si presume abbiano una funzione immunoregolatrice nell’utero (Vera et al., 2003). In uno studio è stato riportato che le blastocisti in vitro trasferite al settimo giorno in manze riceventi che erano state precedentemente montate da un toro vasectomizzato durante l’estro, hanno prodotto embrioni più lunghi al giorno 14 rispetto ad altre blastocisti trasferite in manze che invece non erano entrate a contatto col toro (Mateo-Otero et al., 2020). Si è concluso quindi che l’esposizione al plasma seminale durante l’accoppiamento ha indotto un ambiente uterino capace di supportare lo sviluppo degli embrioni (Mateo-Otero et al., 2020). In diversi studi, si è visto come il plasma seminale bovino sia stato in grado di aumentare (Ibrahim et al., 2018) o diminuire (Fernandez-Fuertes et al., 2019) l’espressione di IL-6 da espianti endometriali (Borges et al., 2012). Il plasma seminale bovino ed il seme hanno aumentato l’espressione sia di citochine pro infiammatorie (IL-6, IL-8) che di citochine antinfiammatorie (IL-10) da parte di cellule epiteliali endometriali e oviduttali in cultura (Ezz et al., 2019; Nongbua et al., 2020).
Le “embriochine” sono parzialmente prodotte da mastociti, macrofagi e cellule Natural Killer che popolano l’endometrio uterino sin dall’inizio della gestazione (Figura 3).
Figura 3. Rappresentazione schematica dei cambiamenti che avvengono da un utero non gravido (a sinistra) all’inizio della gestazione utero (a destra). I cambiamenti includono un aumento delle dimensioni dell’epitelio e endometrio uterino e una infiltrazione di mastociti (MC), macrofagi (MG), cellule natural killer (NK), cellule dendritiche (DC) e cellule T regolatorie (Tregs, TC). Un ulteriore cambiamento è dato da una maggiore produzione di interleuchina-6 (IL-6) e del fattore inibitorio della leucemia (LIF). La rappresentazione è un mosaico di informazioni ottenute per specie diverse e non intende rappresentare una singola specie.
Nell’utero, i macrofagi sono localizzati nell’endometrio, in stretta connessione con le cellule epiteliali, e partecipano alla comunicazione trofoblasto-materna e al rimodellamento uterino in preparazione per impianto (Zhang et al., 2017; Wang et al., 2020). I macrofagi possono specializzarsi per avere un’azione pro o anti infiammatoria a seconda dei diversi profili di secrezione citochinica (Duque e Descoteaux, 2014). Il passaggio da una azione pro-infiammatoria ad una anti-infiammatoria durante la fase del peri-impianto è in parte diretta da linfociti T regolatori CD4 + (Tregs) reclutati nell’utero durante le prime fasi della gestazione (Okeke e Uzonna, 2019). Le cellule Tregs possono anche regolare direttamente l’infiammazione uterina e promuovere la tolleranza immunitaria materna, indipendentemente dai macrofagi CD14+ (Williams, 2012). La regolazione dell’infiammazione comporta una divergenza di Tregs dal tipo Th1 (producono citochine pro-infiammatorie) al tipo Th2 (producono citochine anti-infiammatorie). L’alterazione delle cellule Tregs porta a ricorrenti aborti nella specie umana (Robertson et al., 2018). Recenti lavori effettuati nei bovini e in altri ruminanti suggeriscono che i cambiamenti nelle cellule Th1 e Th2 nel sangue durante l’inizio della gestazione fanno anche parte della risposta immunitaria sistemica materna verso il feto (Ott, 2019, 2020). Cellule natural killer (NK) vengono inoltre reclutate nell’utero all’inizio della gestazione e si infiltrano nella decidua durante la fase del peri-impianto insieme alle cellule Tregs (Mor et al., 2011; Faas e de Vos, 2017). Nei bovini si sono verificati aumenti notevoli nel numero di cellule macrofagiche CD14+ e cellule dendritiche nell’endometrio nei primi 7-13 giorni di gestazione (Mansouri-Attia et al., 2012; Fair, 2016) e le CD14+ si sono ritrovate anche successivamente (Oliveira et al., 2010). Ad oggi si ritiene che il meccanismo immunitario predominante nella specie bovina sia rappresentato dalle citochine derivanti dai macrofagi, probabilmente per via di una diversa tipologia di placentazione (emocoriale vs sindesmocoriale) nelle specie umana/murina e bovina rispettivamente (Mansouri-Attia et al., 2012). Oltre alle azioni sull’utero, i macrofagi influenzano anche la struttura e la funzione del corpo luteo sia nei bovini (Fair, 2015) che nei topi (Care et al., 2013).
Conclusioni
Si è visto che il trasferimento di embrioni bovini prodotti in vitro nell’ovidotto di ovini, per un periodo di tempo limitato, aumenta la qualità embrionale, in particolare per quanto riguarda la sopravvivenza dopo la crioconservazione, e si traduce in una più alta percentuale di gravidanze dopo il trasferimento in bovine riceventi (Enright et al., 2000; Lazzari et al., 2010). Questa è una chiara evidenza che i fattori presenti nel tratto riproduttivo femminile supportano lo sviluppo embrionale precoce. Nei bovini, l’embrione entra nell’utero dopo 4-5 giorni di gestazione e l’utero secerne citochine e altri fattori che influenzano il prodotto del concepimento, e preparano l’endometrio per l’impianto. Differenze tra le razze (carne o latte) nella capacità uterina di supportare lo sviluppo e l’impianto precoce dell’embrione (McMillan et al., 1999; Peterson e Lee, 2003) potrebbero essere in parte dovute a differenze nella comunicazione immunitaria materno-fetale. La produzione in vitro di embrioni continuerà ad aumentare rapidamente per i bovini, data la domanda globale di proteine di origine animale e la necessità di bilanciare il benessere con l’efficienza produttiva. Il prossimo step nell’allevamento intensivo bovino dipenderà da una più profonda comprensione delle condizioni interne del tratto riproduttivo, responsabili di ottimizzare la sopravvivenza degli embrioni e che facilitino l’impianto e il successivo instaurarsi della gravidanza. L’immunologia dello sviluppo e dell’impianto embrionale precoce è un’area che deve essere meglio compresa nella specie bovina. È infatti ipotizzabile che una più profonda comprensione dell’immunologia dello sviluppo embrionale potrebbe portare a trattamenti che inducono un ambiente immunologico più favorevole alla sopravvivenza degli embrioni e al mantenimento della gravidanza nella specie bovina.
A review by Giuseppe Campanile, Pietro.S. Baruselli, Antonio Limone, Michael.J. D’Occhio
Theriogenology. 2021; 167:1-12. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2021.02.020
A cura di Angela Salzano – Dipartimento di Medicina Veterinaria e Produzioni Animali, Università degli Studi di Napoli “Federico II”
