La mortalità embrionale precoce, definita da Walsh et al (2011) come il fallimento della gravidanza durante il periodo tra la fecondazione e il 42° giorno di gestazione, rappresenta ancora una delle maggiori problematiche nella gestione riproduttiva, particolarmente negli allevamenti da latte.

Questo problema a maggior ragione riveste importanza nell’allevamento bufalino, in cui la stagionalità riproduttiva, tipica della specie, influisce sull’efficienza dei programmi di allevamento.

Una delle strategie per migliorare le prestazioni riproduttive mira ad accorciare il periodo interparto identificando precocemente le gravidanze e le eventuali perdite embrionali allo scopo reinserire rapidamente gli animali non gravidi nei piani riproduttivi.

La gravidanza può essere monitorata utilizzando vari metodi: da quelli diretti come l’ecografia, ai metodi indiretti come il dosaggio del progesterone o delle glicoproteine associate alla gravidanza.

Nella bufala, l’applicazione dell’ecografia trans-rettale per la diagnosi di gravidanza e il monitoraggio dello sviluppo embrionale è stata descritta da diversi autori (Pawshe et al., 1994; Karen et al., 2007; Sharma et al., 2012). Il rilevamento del battito cardiaco è segno inequivocabile della vitalità dell’embrione ed è evidenziabile tra il 23° e il 28° giorno di gestazione.

L’assenza del battito cardiaco insieme alla disorganizzazione delle membrane della vescicola embrionale e/o la presenza di strutture fluttuanti all’interno della vescicola, indicanti i resti del conceptus, ci permettono di diagnosticare la morte dell’embrione. Pertanto l’utilizzo dell’ecografia consente di diagnosticare le perdite precoci di gravidanza. Tale metodo, tuttavia, presenta lo svantaggio di avere un’accuratezza limitata prima del 28°-30° giorno di gestazione e comunque non è predittivo di una eventuale mortalità embrionale.

Il progesterone (P4) è un ormone che viene prodotto dal corpo luteo (CL) durante il ciclo estrale e dalla placenta durante la gravidanza. Il dosaggio del P4 nel sangue o nel latte ai giorni 20, 22 e 24 dopo la fecondazione è stato utilizzato per la diagnosi precoce della gravidanza nelle bufale (Arora and Pandey,1982; Kaul and Prakash, 1994).

Sebbene le concentrazioni di P4 aiutino a rilevare la gravidanza, una singola analisi non fornisce informazioni sufficienti a valutare accuratamente lo stato di gravidanza e non fornisce informazioni sulla vitalità dell’embrione. In realtà, la concentrazione di P4 riflette più la funzione del CL che non la presenza o la vitalità di un embrione o di un feto.

Le glicoproteine associate alla gravidanza (PAGs) costituiscono una grande famiglia di glicoproteine, sintetizzate dalle cellule mono e binucleate del trofoblasto e rilasciate nel sangue materno al momento dell’impianto. Nella bufala, la loro presenza rilevabile nel sangue materno dalla terza settimana di gestazione fino al parto (Barbato et al, 2013; 2017), le identifica come biomarker precoce di gravidanza. A differenza dei metodi descritti precedentemente, il dosaggio delle PAGs consente di valutare la vitalità dell’unità feto-placentale, e predire, sulla base della quantità presente in circolo, una possibile perdita dell’embrione.

Allo scopo di valutare la miglior strategia per diagnosticare le perdite precoci di gravidanza nella bufala, è stato condotto uno studio che ha messo a confronto i tre diversi metodi diagnostici: ecografia, P4 e PAGs. Lo studio, inoltre, ha voluto verificare se la determinazione delle PAGs potesse facilitare la diagnosi delle mortalità embrionali precoci nella bufala.

L’indagine è stata condotta su 109 bufale sottoposte a un programma di sincronizzazione dei calori e inseminazione artificiale (IA) a tempo fisso, nella azienda sperimentale del CREA di Monterotondo (Roma). I prelievi di sangue sono stati effettuati ai giorni 0, 14, 25, 28 e 40 post-IA per il dosaggio del P4 e delle PAGs. Le analisi sono state effettuate mediante tecnica RIA (Radio Immuno Assay).

In base ai risultati del dosaggio del P4, le bufale sono state considerate gravide quando nei giorni 14, 25, 28 e 40 le concentrazioni plasmatiche erano superiori a 1 ng/mL. Sulla base dei risultati del dosaggio delle PAGs, le bufale sono state considerate non gravide quando le concentrazioni rimanevano molto vicine allo zero in tutti i punti di prelievo e gravide quando le concentrazioni nei giorni 25, 28 e 40 erano superiori a 1 ng/mL. Quando le PAGs erano pari o superiori a 1 ng/mL al 25° giorno e scendevano sotto 0,2 ng/mL al 40° giorno, si è ritenuto che si fosse verificata una mortalità embrionale.

La diagnosi ecografica è stata eseguita nei giorni 25, 28 e 40 dalla IA. Le osservazioni ecografiche sono state classificate in quattro categorie: nessuna vescicola, vescicola, vescicola + embrione, vescicola + embrione + battito. La presenza della vescicola embrionale e dell’embrione con battito cardiaco è stata usata come criterio per la diagnosi positiva. La mortalità embrionale è stata diagnosticata quando la vescicola embrionale e/o l’embrione con battito cardiaco non era più visibile nelle ecografie successive. Nelle bufale diagnosticate non gravide non è stata rilevata alcuna vescicola embrionale in nessun dei giorni delle osservazioni. La diagnosi di gravidanza è stata ripetuta a 60 giorni.

Sulla base della diagnosi ecografica effettuata a 40 giorni, gli animali sono stati classificati ex post nei gruppi: Gravide (n = 50), Non-gravide (n= 47) e Mortalità (n = 12).

Un’associazione significativa è stata riscontrata tra le osservazioni ecografiche e l’esito della diagnosi. La maggior parte delle mortalità embrionali è stata diagnosticata tra 28 e 40 giorni post-IA. Il rilievo del battito cardiaco si è rivelato importante nel predire l’esito della gravidanza. Infatti, le probabilità di mortalità aumentavano di circa 15 volte se il battito cardiaco era stato assente nel rilievo a 28 giorni.

Al giorno 40, tutti gli animali nei quali era stata rilevato vescicola embrionale + embrione + battito cardiaco, hanno mantenuto la gravidanza fino alla diagnosi successiva a 60 giorni post-AI.

Lo svantaggio del metodo ecografico è che prima dei 28 giorni di gestazione non si è rivelato utile a predire la mortalità embrionale. Ciò risulta in accordo con quanto riportato da altri gruppi di ricerca che hanno condotto studi simili sulla bovina.

Per quanto riguarda i marker biologici, le bufale che avevano mantenuto la gravidanza avevano concentrazioni circolanti significativamente più elevate sia di PAGs che di P4 a partire dal 25° giorno dopo l’IA fino alla fine del periodo dei rilievi ematici.

Le probabilità di mortalità si sono mostrate cinque volte superiori se il valore di P4 era inferiore o uguale a 2,6 ng/ml ai giorni 25 e 28. Il valore di P4 più basso nel gruppo di mortalità potrebbe indicare una minore funzionalità del CL che potrebbe aver contribuito al riassorbimento dell’embrione.

Come ricordato precedentemente, il P4 riflette l’attività CL più che la presenza di un embrione. Quindi la persistenza del CL dopo una morte embrionale, o l’inizio di un nuovo ciclo estrale dopo il riassorbimento dell’embrione, porta a rilevare comunque un valore positivo di P4 nel sangue, benché non correlato alla gravidanza. Pertanto, la non specificità di P4 e la presenza di possibili falsi positivi limita l’uso di questo metodo come marker di vitalità embrionale.

Le PAGs, invece, essendo secrete dal tessuto trofoblastico attivo, indicano la presenza di un embrione vitale. Nella bufala questa proteina può essere rilevata nel sangue degli animali gravidi a partire dal 25° giorno post-AI, con un’accuratezza del 99% al 28° giorno di gestazione, fornendo così un test accurato per il monitoraggio della gravidanza (Barbato et al., 2013; 2017; 2018).

Sulla base dei risultati di questo studio, le probabilità di mortalità si sono mostrate sei volte superiori quando le concentrazioni di PAGs erano inferiori o uguali al cut-off di 1,1 ng/ml e di 2,2 ng/ml, rispettivamente ai giorni 25 e 28. Le basse concentrazioni di PAGs riscontrate nelle bufale con mortalità a partire dal giorno 25 post-IA, suggeriscono una possibile sofferenza embrionale nella fase iniziale della gestazione. Concentrazioni più elevate di PAGs, invece, si sono mostrate correlate ad una minore incidenza di perdita embrionale, come riportato anche per i bovini.

Tra i metodi diagnostici analizzati in questo studio, il dosaggio delle PAGs si è mostrato essere il migliore come marcatore per la previsione della mortalità embrionale nel bufalo tra i 25 e i 40 giorni di gestazione. Il dosaggio del P4, invece, è risultato essere un metodo meno affidabile come indicatore della perdita di gravidanza sia rispetto alle PAGs che all’ecografia.

Lo svantaggio della diagnosi ecografica è che lo stato di gravidanza è garantito solo al momento della diagnosi. Diversamente, le PAG riflettono il benessere dell’embrione e quindi la riduzione delle loro concentrazioni circolanti è un segno prognostico di fallimento della gravidanza.

Bibliografia

Arora, R.; Pandey, R. Changes in peripheral plasma concentrations of progesterone, estradiol-17β, and luteinizing hormone during pregnancy and around parturition in the buffalo (Bubalus bubalis). Gen. Comp. Endocrinol. 1982, 48, 403–410.

Barbato, O.; Melo de Sousa, N.; Barile, V.L.; Canali, C.; Beckers, J.-F. Purification of pregnancy-associated glycoproteins from late-pregnancy Bubalus bubalis placentas and development of a radioimmunoassay for pregnancy diagnosis in water buffalo females. BMC Vet. Res. 2013, 9, 89, doi:10.1186/1746-6148-9-89.

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Sharma, R.; Singh, J.; Khanna, S.; Phulia, S.; Sarkar, S.K.; Singh, I. Fetal age determination in Murrah buffaloes from days 22 through 60 with ultrasonography. 2012.

Walsh, S.; Williams, E.; Evans, A. A review of the causes of poor fertility in high milk producing dairy cows. Anim. Reprod. Sci. 2011, 123, 127–138, doi:10.1016/j.anireprosci.2010.12.001.

Autori

La presente sinossi è stata redatta da Olimpia Barbato1 e Vittoria Lucia Barile2.

1. Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Perugia
2. Centro di ricerca Zootecnia e Acquacoltura, CREA Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria, Monterotondo (Roma).

Tratta dall’articolo: “Approaches to Identify Pregnancy Failure in Buffalo Cows” di Barile, V.L.; Menchetti, L.; Casano, A.B.; Brecchia, G.; Melo de Sousa, N.; Zelli, R.; Canali, C.; Beckers, J.F.; Barbato, O. pubblicato su Animals 2021, 11, 487. https://doi.org/10.3390/ani11020487