Abstract
Introduzione
Campionamento
Metodi multi-micotossine
Aflatossine
Tossine dell’Alternaria
Alcaloidi dell’Ergot
Fumonisine
Ocratossine
Patulina
Tricoteceni
Zeralenone
Riconoscimenti
Riferimenti

World Mycotoxin Journal, 2020 online

Articolo in stampa

S.A. Tittlemier1*, B. Cramer2, C. Dall’Asta3, M.H. Iha4, V.M.T. Lattanzio5, C. Maragos6, M. Solfrizzo5, M. Stranska7, J. Stroka8 e M. Sumarah9
1Canadian Grain Commission, Grain Research Laboratory, Winnipeg, MB, R3C 3G8, Canada; 2University of Münster, Institute of Food Chemistry, Corrensstr. 45, 48149 Münster, Germania; 3Università di Parma, Department of Food and Drug, Viale delle Scienze 23/A, 43124 Parma, Italia; 4Adolfo Lutz Institute of Ribeirão Preto, CEP 14085-410, Ribeirão Preto-SP, Brasile; 5National Research Council of Italy, Institute of Sciences of Food Production, via Amendola 122/O, 70126 Bari, Italia; 6United States Department of Agriculture, ARS National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL 61604, USA; 7Department of Food Analysis and Nutrition, Faculty of Food and Biochemical Technology, University of Chemistry and Technology, Praga, Repubblica Ceca; 8European Commission, Joint Research Centre, 2440 Geel, Belgio; 9Agriculture and Agri-Food Canada, London Research and Development Centre, London, ON, N5V 4T3, Canada;
sheryl.tittlemier@grainscanada.gc.ca
Ricevuto: 28 Ottobre 2019/Accettato:  2 Dicembre 2019
© 2020 Wageningen Academic Publishers

Abstract

Questa review riassume gli sviluppi sulle analisi delle micotossine in varie matrici, pubblicate nel periodo che va dalla metà del 2018 alla metà del 2019. I metodi analitici per determinare le aflatossine, le tossine dell’Alternaria, gli alcaloidi dell’Ergot, le fumonisine, le ocratossine, la patulina, i tricoteceni e lo zearalenone sono trattati in singole sezioni. Anche i progressi delle strategie di campionamento sono discussi in una sezione dedicata. Inoltre, sono stati sottoposti a review gli sviluppi raggiunti per i test multi-micotossina, che comprendono metodi basati sulla spettrometria di massa così come i semplici test immunologici. Questa importante review mira a presentare brevemente i più importanti e recenti sviluppi e i trend più adatti per la determinazione delle micotossine, cercando anche di far fronte ai limiti delle metodologie presentate.

Parole chiave: campionamento, analisi multi-micotossina, aflatossine, tossine dell’Alternaria, alcaloidi dell’Ergot, fumonisina, ocratossina A, patulina, tricoteceni, zeralenone, controllo qualità

Introduzione

Questo articolo è l’ultimo di una serie di review annuali che mostrano gli sviluppi dei metodi analitici per la determinazione delle micotossine, che prosegue la precedente review condotta partendo dalla metà del 2017 fino alla metà del 2018 (Tittlemier et al., 2019a). Come nelle precedenti review di questa serie, il nostro scopo principale è quello di far conoscere gli sviluppi e i progressi dei metodi analitici per la determinazione delle micotossine pubblicati tra la metà del 2018 e la metà del 2019. Questa review andrà a completare altre recenti review generali condotte sui metodi di screening per le micotossine da Santana Oliveira et al. (2019) e da Nolan et al. (2019). Come per gli anni passati, in questa review viene analizzata una selezione dei più nuovi ed importanti progressi ottenuti nel campo delle metodologie analitiche, contrapponendoli ai progressivi miglioramenti fatti dalla metodologia meno recente. Questa review non ha l’obiettivo di essere un elenco esaustivo di pubblicazioni sui metodi analitici per le micotossine. Sono previsti commenti critici sui metodi inclusi, sui loro parametri di validazione o sulla loro peculiare applicazione, allo scopo di guidare i lettori nella determinazione dell’impatto di tali sviluppi. Questa review dovrebbe quindi interessare sia i “veterani” che si occupano di micotossine sia i nuovi soggetti che si stanno approcciando a questo campo di studio. Alla luce delle numerose nuove pubblicazioni che si sono avute negli ultimi anni, vorremmo incoraggiare gli analisti ad andare oltre la fase di “proof of concept” per quanto concerne la valutazione delle nuove metodologie o tecnologie, in modo tale da estendere la loro validità. La validazione deve andare al di là della valutazione di prestazioni basata su scenari a breve termine e strettamente controllati che utilizzano materiali di prova semplificati, come le soluzioni di micotossine in solvente. Deve essere condotta una valutazione approfondita delle prestazioni del metodo che deve prevedere opportune matrici, concentrazioni di analita rilevanti, nonché variazioni realistiche delle condizioni del test che si possono verificare nel tempo e con la varibilità degli operatori. Gli argomenti specifici inclusi in questa review sono: campionamento (sezione 2), metodi multi-micotossine (sezione 3), aflatossine (sezione 4), tossine dell’Alternaria (sezione 5), alcaloidi dell’Ergot (sezione 6), fumonisine (sezione 7), ocratossine (sezione 8), patulina (sezione 9), tricoteceni (sezione 10) e zearalenone (sezione 11).

Campionamento

Le ricerche condotte sul campionamento e sull’elaborazione dei campioni pubblicate nell’ultimo anno affrontano un’ampia gamma di tematiche. Tali tematiche riguardano il rapporto costo-efficacia dei vari piani di campionamento (Focker et al., 2018), le considerazioni logistiche da tenere a mente per lo sviluppo di piani di campionamento per studi di ricerca (Pitt, 2019), l’esecuzione dei diversi processi di campionamento (Mallmann et al., 2018), i nuovi metodi di campionamento (Ahmed et al., 2018) e gli effetti del trattamento del campione sull’accuratezza e sulla precisione delle analisi per le micotossine (Damiani et al., 2019); Kumphanda et al., 2019).

Focker et al. (2018) hanno costruito un modello, basato sui risultati storici provenienti dal programma di monitoraggio olandese, per determinare quale piano di campionamento e quali analisi fossero più convenienti per attenersi alle normative dell’Unione Europea (UE), per il deossinivalenolo (DON) nel grano e per l’aflatossina B1 (AFB1) nel mais destinato al consumo umano o alla realizzazione di mangimi. Il loro modello massimizzava il numero di decisioni corrette accettate/rifiutate all’interno di un certo numero di budget stabiliti variando il metodo analitico utilizzato (cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem, saggio immunoenzimatico (ELISA) o i dispositivi a flusso laterale (LFD), il numero di campioni elementari prelevati dal lotto di cereali e combinati in un campione aggregato e il numero di quote del test analizzate dall’aggregato sminuzzato. In termini di costi, i piani più convenienti per una partita di cereali alla rinfusa erano quelli che impiegavano metodi strumentali o ELISA. Per l’AFB1 nel mais, il piano ottimale per tutti i budget superiori ai 500 euro raccoglieva il maggior numero possibile di campioni incrementali, grazie alla maggiore eterogeneità delle aflatossine nel mais rispetto all’eterogeneità della distribuzione del DON nel grano. La percentuale di decisioni corrette nei piani per l’AFB1 variava dall’87.9 al 92.4%. Per il DON nel grano, c’era una differenza minima tra i vari piani di campionamento; la percentuale di decisioni corrette variava dal 96.2 al 98.5%. Focker et al. (2018) hanno incluso un’ottima discussione su come le loro ipotesi di costo abbiano avuto un impatto sui risultati del modello, pertanto si consiglia vivamente ai lettori di valutare come i propri costi si allineino con i presupposti utilizzati in questo documento prima di intraprendere piani analoghi.

Il recente articolo di opinione di Pitt (2019) sul biocontrollo per la riduzione delle aflatossine nel mais, contiene un’ottima discussione sulle sfide riguardanti la valutazione delle concentrazioni di aflatossine nel mais sulla base del campionamento e della processazione del campione. In particolare, Pitt ha utilizzato il FAO Mycotoxin Sampling Tool disponibile online (FAO, 2013) per determinare i limiti di confidenza dei risultati sulle aflatossine riportati negli studi pubblicati per il mais, nonché per stimare i relativi contributi del campionamento, della processazione del campione e dell’analisi della varianza totale dei risultati sull’aflatossina. La sua discussione dimostra chiaramente che in uno studio, la mancanza di replicazione al momento della fase di campionamento e di elaborazione del campione, ridurrà notevolmente, o addirittura eliminerà, la capacità di discernere statisticamente le differenze tra i trattamenti. L’articolo di Pitt evidenzia anche la necessità di fare una riflessione sull’impatto di un accurato piano di campionamento, attraverso un’attenta discussione di come i numerosi kg di mais necessari per minimizzare la varianza (mediante l’impiego di repliche del campione e di campioni di grandi dimensioni), potrebbero non essere raggiungibili in situazioni laddove la resa dei produttori può essere solamente di 1-2 tonnellate.

Mallmann et al. (2018) hanno valutato la presenza di micotossine nel mais e nel grano mediante due processi di campionamento che prevedevano l’utilizzo di una sonda pneumatica per il campionamento di grano, immagazzinato in silos che ne contenevano circa 1000 tonnellate, a seconda dei diversi modelli di sondaggio. L’elaborazione del campione è stata scrupolosa e tenuta in particolare considerazione, poiché i campioni relativamente grandi (triplicare i campioni da 4 e da12 kg per ogni localizzazione nei rispettivi processi di campionamento) sono stati macinati grossolanamente prima della suddivisione con un separatore di tipo riffle e sottoposti ad un ulteriore sminuzzamento. Mallmann et al. non hanno osservato una differenza significativa tra i due processi di campionamento per quanto concerne la variabilità dei risultati relativi ad aflatossine, fumonisine o zearalenone (ZEN) nel mais o ZEN nel grano. Hanno tuttavia evidenziato che il coefficiente di variabilità del DON era significativamente più basso (10.1 vs 22.2%) quando veniva preso in esame il metodo di sondaggio, che prevedeva l’acquisizione del campione sezionando il silos contenente il grano in tre strati orizzontali lungo tutta l’altezza del silos stesso, rispetto ad un sondaggio che copriva l’intera profondità del silos ma in un singolo punto di campionamento. Mentre si è discusso su come la variabilità spaziale della presenza di micotossine all’interno di un silos potesse essere dovuta alla segregazione delle particelle durante il suo riempimento, gli autori non hanno indagato se la rimozione del grano dalle varie posizioni nei silos potesse aver perturbato la struttura o la dimensione della contaminazione da micotossine localizzate e se potesse aver influenzato la varianza tra i replicati. Queste considerazioni sottolineano la complessità degli studi sperimentali nella valutazione degli effetti della campionatura dei prodotti sfusi.

La prova di concetto per il campionamento dello spazio di testa intorno alle colonie fungine, utilizzando nuovi metodi passivi ed attivi, è stata dimostrata da Ahmed et al. (2018). Sostanze volatili associate alla biosintesi di micotossine da parte di Aspergillus fumigatus sono state raccolte utilizzando tubi per desorbimento termico contenenti un polimero organico poroso (Tenax TA) e carbon black grafitato (Carbograph 5 TD) come adsorbenti. Pur non essendo direttamente incentrato sull’analisi delle micotossine, questo lavoro è comunque rilevante in quanto gli autori hanno notato che alcune delle sostanze volatili erano specificamente associate o a fasi di crescita fungina precoci (pirazina e metilpirazina) o a fasi più tardive (terpeni). Queste osservazioni sottolineano la necessità, quando si studia un sistema dinamico, di considerare  il periodo di tempo del campionamento.

Damiani et al. (2019) hanno esaminato l’effetto della dimensione delle particelle di mais sminuzzato sull’efficacia dell’estrazione della fumonisina B1 (FB1) e della fumonisina B2 (FB2). Il mais sminuzzato è stato suddiviso in base alle dimensioni delle particelle e quindi analizzato per le due fumonisine. In tutti e quattro i campioni naturalmente contaminati, l’efficacia dell’estrazione da ogni frazione aumentava man mano che le dimensioni delle particelle diminuivano. Le concentrazioni nelle frazioni con dimensioni delle particelle più piccole di 250 μm erano da 1.3 a 4 volte superiori rispetto alle concentrazioni misurate nelle quote di mais macinato non frazionato. Gli autori hanno attribuito questo ad un incremento dell’area disponibile per l’estrazione con solvente delle fumonisine e quindi c’è stato poco o nessun impatto dovuto alla diffusione dell’analita dall’interno del materiale solido alla sua superficie esterna. Questo lavoro dimostra che la triturazione del campione in particelle con dimensioni più piccole potrebbe non solo ridurre la varianza dei risultati dei test, ma potrebbe anche influenzare l’accuratezza dei risultati dei test.

Kumphanda et al. (2019), durante l’analisi delle micotossine nel mais, si sono concentrati anche sugli effetti della lavorazione cui sono sottoposti i campioni, nell’ambito di una riduzione al minimo dei costi associati all’estrazione e all’analisi di aliquote più grandi impiegate per i test e comunemente raccomandate per ridurre la varianza dei dati. Questo studio approfondito prevedeva una serie di esperimenti. Un esperimento caratterizzava la preparazione del campione e la varianza analitica con l’impiego di aliquote di prova (50 e 12.5 g) preparate macinando campioni di laboratorio con un mulino Romer, così come la dimensione ottimale dell’aliquota di “slurry” per il test (25 g) determinata in un esperimento preliminare. Le relative varianze medie combinate erano, rispettivamente, di 15:5:1 per la macinazione a secco da 12.5 g, per la macinazione a secco da 50 g e per le aliquote di “slurry” da 25 g. Infatti la varianza nelle concentrazioni di aflatossine, ottenuta dalle aliquote per i test sullo “slurry”, era abbastanza bassa da essere paragonabile alla varianza dovuta al particolare immunodosaggio fluorimetrico usato per quantificare le aflatossine. Gli autori hanno discusso le differenze di varianza osservate tra le diverse aliquote dei test  nel contesto della massa del campione e della dimensione delle particelle, ma purtroppo non hanno delineato le distribuzioni granulometriche prodotte dall’impiego del mulino Romer e le tecniche di miscelazione dello “slurry”. Poiché il mulino Romer sembrerebbe produrre una distribuzione granulometrica più grossolana rispetto ad altri macinatori (Tittlemier et al., 2017), il vantaggio dello slurry notato da Kumphanda et al. (2019) potrebbe non essere reale se venisse eseguita una macinazione a secco più intensa allo scopo di produrre particelle più piccole. Gli autori hanno anche notato una maggiore efficienza di estrazione per lo “slurry”, come è stato osservato per le frazioni con granulometria più piccola del mais da Damiani et al. (2019), suggerendo che il vantaggio ottenuto dall’impiego dello “slurry” era dovuto alle dimensioni più piccole delle particelle rispetto a quelle prodotte dal mulino Romer. Kumphanda et al. (2019) hanno anche fornito un’eccellente discussione sul “preoccupante” trend che prevede una riduzione delle masse delle aliquote di prova nelle pubblicazioni che riguardano l’analisi delle micotossine nei vari prodotti.

Metodi multi-micotossine

Data la disponibilità globale di strumentazione completa per la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), l’impiego di procedure generiche di preparazione del campione basate su QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) è, ad oggi, molto adottato per l’analisi multipla delle micotossine eseguita di routine. Questo approccio rappresenta la strategia più comunemente applicata quando si studiano le prospettive di analisi per nuovi binomi micotossina/materia prima. Detto ciò, le principali innovazioni di quest’anno sono relative alla sperimentazione di  nuovi materiali in grado di migliorare l’efficienza delle metodologie basate su QuEChERS.

Una metodica ad altissime prestazioni che prevede l’impiego di cromatografia liquida-spettrometria di massa in tandem (UHPLC-MS/MS) basata sulla procedura QuEChERS, che include uno step di estrazione in fase solida dispersiva (dSPE) con un adsorbente C18, è stata messa a punto per la determinazione di micotossine come α-zearalenolo (α-ZEL), ZEN, AFB1, aflatossina B2 (AFB2), aflatossina G1 (AFG1) e aflatossina G2 (AFG2) negli oli alimentari (Hidalgo- Ruiz et al., 2019). In contrasto con il trend comune, che prevede l’inclusione del maggior numero possibile di micotossine/materie prime, il lavoro di Hildago-Ruiz et al. (2019) si rivolge ad un target scientificamente adeguato ed è dedicato a un solo prodotto, sebbene includa un’ampia gamma di tipologie rappresentative, ovvero diversi oli d’oliva (olio extra vergine di oliva, olio di oliva, olio di oliva lampante e olio di oliva raffinato), due tipologie di olio di sansa, due tipologie di olio di girasole, olio di soia e olio di mais. Ciò ha permesso ai ricercatori di studiare a fondo la variabilità degli effetti della matrice, al fine di valutare se fosse possibile utilizzare una curva di calibrazione assistita comune. Si è visto che, per la maggior parte delle matrici, gli effetti della matrice erano analoghi a quelli dell’olio extra vergine di oliva, ad eccezione  dell’olio di sansa grezzo, nel quale era presente un forte effetto di soppressione degli ioni per le aflatossine, e che era l’unico che necessitava di una specifica curva di calibrazione assistita per la matrice. Il metodo è stato validato ottenendo limiti di quantificazione di 0.5 μg/kg per le aflatossine e di 1 μg/kg per α-ZEL e ZEN, recuperi (valutati nell’intervallo 0.5-25 μg/kg) dall’80 al 120%, e valori di precisione intra e inter-giornalieri inferiori al 20%.  È stata valutata anche l’incertezza estesa, U, ed era inferiore al 32% a 25 μg/kg. Il metodo sviluppato è stato applicato per la determinazione delle sei micotossine in 194 campioni di olio, implementando una procedura interna di controllo della qualità per garantire l’affidabilità dei risultati. Questa prevedeva l’iniezione di un campione in bianco per verificare la presenza di interferenze e una curva di calibrazione matrix-matched utilizzando l’olio extra vergine di oliva e campioni addizionati per controllare l’efficienza dell’estrazione.

La frutta secca, come gli oli, rappresenta una matrice complessa le cui componenti principali sono i lipidi. Alcantara-Duran et al. (2019) hanno proposto un approccio alternativo che va a sostituire il tradizionale adsorbente ammina primaria/secondaria (PSA)/C18 con un nuovo adsorbente (Enhanced Matrix Removal (EMR) Lipid) per la fase dSPE nel processo QuEChERS. Gli autori hanno riferito sui dati ottenuti dal confronto dei due trattamenti per quanto riguarda gli effetti della matrice e i recuperi, dimostrando che l’utilizzo dell’adsorbente EMR-Lipid potrebbe migliorare significativamente le prestazioni del metodo quando si parla di frutta secca (mandorle, arachidi e pistacchi). Anche se la selezione delle micotossine bersaglio, che oltre alle aflatossine includeva alcune micotossine che solitamente non contaminano la frutta secca come gli alcaloidi dell’Ergot (EA), potrebbe essere discutibile, il lavoro di Alcantara Duran et al. (2019) può essere considerato un valido esempio di sviluppo della preparazione del campione specifico per la materia prima da esaminare, che ha cercato di far fronte ai problemi specifici derivanti dalla composizione della matrice. Nel complesso, il metodo è stato completamente validato rivelando tassi di recupero dal 75 al 98% e una precisione soddisfacente con relativi valori di deviazione standard ripetibili (RSDr) inferiori al 19%.

Tra i nuovi adsorbenti da utilizzare nei metodi di tipo QuEChERS, i nano materiali di carbonio, in particolare i nanotubi di carbonio a parete multipla (MWCNTs), vengono identificati come uno strumento promettente per l’analisi delle micotossine. Alcune applicazioni sviluppate nell’ultimo decennio, e riviste da Reinholds et al. (2019), hanno evidenziato i vantaggi dei MWCNT modificati magneticamente che consentono l’isolamento del campione attraverso la separazione magnetica, riducendo l’interazione delle nanoparticelle e migliorando il recupero delle micotossine. I MWCNT hanno strutture e caratteristiche speciali, tra cui un’ampia e specifica area di superficie e possono essere modificati, ad esempio, con l’introduzione di nanoparticelle di Fe3O4 che conferiscono proprietà magnetiche al materiale adsorbente. La separazione degli estratti e degli adsorbenti può essere effettuata immediatamente senza la necessità di centrifugare i dispositivi, diminuendo le tempistiche dell’analisi.

Ma et al. (2019), hanno studiato a fondo questa metodologia, sia per quanto concerne la composizione del solvente di estrazione sia per quanto riguarda la tipologia e la quantità di Fe3O4-MWCNT. Il lavoro ha portato alla messa a punto di un metodo UHPLC-MS/MS per la determinazione simultanea di 20 micotossine nei cereali. In condizioni ottimizzate, il metodo ha mostrato una linearità soddisfacente (r2 ≥ 0.9965), recuperi (73-113%), precisione (1.3-12.7%) e una sensibilità adeguate (limiti di quantificazione (LOQ) che vanno da 0.002 a 5.4 μg/kg). Tuttavia, questo adsorbente non è disponibile in commercio, pertanto la sintesi e la caratterizzazione (dimensioni e morfologia) dei compositi Fe3O4-MWCNT deve essere tenuta in considerazione durante la procedura analitica. Questo richiederebbe la disponibilità di tecniche come la microscopia elettronica a trasmissione, la diffrazione dei raggi X e le analisi spettroscopiche a infrarossi con trasformata di Fourier (FT-IR). Pertanto, nonostante le soddisfacenti prestazioni analitiche del metodo validato, ci dobbiamo porre alcune domande sulla sua riproducibilità e sulla sua trasferibilità ad altri laboratori. Un ulteriore esempio dell’impiego dei MWCNT, in combinazione con un adsorbente C18, lo ritroviamo in Jiang et al. (2018). Questo documento viene discusso più dettagliatamente nella sezione 10. Viene descritta un’attenta ottimizzazione della procedura dSPE per quanto riguarda i recuperi delle tossine e gli effetti di matrice, tuttavia nel manoscritto non sono riportati né la fonte dei MWCNT né il loro protocollo di sintesi e caratterizzazione, cosa che mette in discussione la riproducibilità del metodo in altri laboratori.

 Un metodo ad ampio spettro è stato sviluppato per l’analisi simultanea di citrinina (CIT) e ocratossina A (OTA) nei mangimi (pollo e maiale) e negli alimenti (prodotti a base di cereali, frutta, succhi di verdura, frutta secca, semi, erbe, spezie, prodotti vegetariani e a base di soia, bevande alcoliche, prodotti alimentari per l’infanzia e integratori alimentari) tramite UHPLC-MS/ MS (Meerpoel et al., 2018). Nonostante la semplicità del QuEChERS applicato (senza dSPE) nella procedura di preparazione del campione, si è posta particolare attenzione all’ottimizzazione della composizione del solvente di estrazione. Sono state impiegate miscele specifiche per la materia prima analizzata per tener conto delle differenze (ad es. nel contenuto di acqua o di grassi) tra i gruppi di prodotti coinvolti nell’analisi. È stata effettuata un’esauriente validazione del metodo secondo i criteri descritti nel Commission Regulation No 401/2006/EC (EC, 2006a) e nel Commission Decision No 2002/657/EC (EC, 2002). L’idoneità allo scopo del metodo è stata dimostrata tramite l’analisi di 90 campioni di mangime con diversa composizione, che ha rivelato la presenza simultanea di CIT (< LOQ-390 μg/kg) e OTA (< LOQ-5,60 μg/kg) in più del 50% di questi prodotti. È interessante notare che gli autori hanno esaminato l’applicabilità del metodo sviluppato alle matrici appartenenti allo stesso gruppo di materie prime, come definito nel Commission Regulation  No 519/2014/UE (EC, 2014). Per ogni gruppo di materie prime è stata utilizzata una calibrazione matrix-matched “comune”. Quest’ultimo aspetto è sicuramente in linea con i prossimi sviluppi delle linee guida per la convalida dei metodi di analisi (multi)-micotossina. La classificazione degli alimenti/mangimi in “gruppi di materie prime”, che implica la validazione del metodo per una materia prima rappresentativa per ciascun gruppo (CE, 2014), è un esempio degli approcci più pratici presi in prestito dalle linee guida di convalida stabilite per i residui dei pesticidi (CE, 2017).

Le attuali linee guida per la validazione e gli strumenti per la valutazione delle performance dei metodi LC-MS destinati alla determinazione quantitativa e allo screening semiquantitativo di più micotossine, sono stati rivisti da Pascale et al. (2019). Gli autori della review hanno cercato di affrontare la questione dell’idoneità allo scopo degli attuali criteri di accettazione e delle performance dei metodi per l’individuazione delle micotossine in vista del trend osservato che porta verso l’impiego di metodi sviluppati internamente piuttosto che di metodi convalidati in collaborazione, e del passaggio dai classici metodi standard per le micotossine singole ai metodi multi-micotossina basati su LC-MS/MS che si sta verificando rapidamente (in effetti troppo rapidamente affinché l’adeguamento degli standard possa tenere il passo con tali progressi). È fortemente consigliato anche un riesame delle linee guida per la validazione e dei criteri per le performance dei metodi di screening LC-MS. Le linee guida specifiche per la convalida e la verifica dei metodi di screening delle micotossine stabilite nel Commission Regulation No 2014/519/UE (CE, 2014) sono un primo passo in questa direzione.

Tra gli strumenti disponibili per il controllo della qualità, utili a garantire il rispetto dei criteri di performance, le micotossine marcate continuano ad essere essenziali per garantire una quantificazione accurata, nonché una corretta gestione degli effetti della matrice, in particolare nei laboratori di controllo ufficiali, nonostante i loro costi elevati. Zhang e Xu (2019a) hanno proposto l’implementazione dell’approccio SIDA (stable isotope dilution assay) per l’analisi multi-micotossina LC-MS/MS (aflatossine, tricoteceni, fumonisine, ZEN) negli oli destinati al consumo. Si trattava di un follow-up di precedenti studi di convalida che dimostravano l’idoneità allo scopo dei metodi SIDA LC-MS/MS per l’analisi multi-micotossina di routine prevista dalla legge all’interno dei programmi di sorveglianza e dei test di conformità della Food and Drug Administration degli Stati Uniti. In questo studio, i campioni di olio sono stati marcati, secondo gli standard interni, con 13C per le 12 micotossine target e sottoposti successivamente ad estrazione utilizzando acetonitrile/acqua (v/v) al 50%. L’approccio SIDA ha permesso la quantificazione utilizzando standard di calibrazione in solvente puro. Inoltre, l’articolo descrive l’applicazione di uno strumento statistico di analisi delle componenti principali, relativamente facile da utilizzare, per studiare l’influenza di una varietà di fattori come la matrice del campione, la concentrazione di arricchimento e/o le singole micotossine, sulle prestazioni del metodo durante tutto lo studio. Utilizzando questo approccio, si potrebbero osservare possibili anomalie ed un’analisi alla radice delle cause di tali osservazioni sospette potrebbe portare ad una migliore comprensione delle prestazioni del metodo. I recuperi del metodo ottimizzato nell’intervallo di picco testato (da 10 a 1000 μg/kg) sono stati dell’80-120% con valori di RSDr inferiori al 20%. I LOQ variavano da 0.1 μg/kg (AFB1) a 6.4 μg/kg (ZEN). Su 16 campioni provenienti da negozi statunitensi, lo ZEN è stato rilevato in tre campioni di olio di mais a concentrazioni di 37, 185 e di 317 μg/kg, rispettivamente.

In un recente studio, un metodo di cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) destinato allo screening di tutte le principali micotossine controllate per legge, e precedentemente convalidato da uno studio collaborativo, è stato confrontato con altri metodi di screening basati su saggi immunoenzimatici, come ELISA, LFD e con un saggio immunoenzimatico a polarizzazione di fluorescenza (FP) (Lattanzio et al., 2019). Lo studio è stato organizzato come uno studio collaborativo, ed ha coinvolto 20 tecnici che hanno utilizzato tali metodi per la prima volta. Sono stati analizzati materiali di riferimento per la presenza di DON e AFB1 nel grano. I risultati sono stati valutati statisticamente per poter calcolare la precisione del metodo, i valori di cut-off e il tasso di falsi risultati sospetti, poi confrontati con i risultati di studi di convalida eseguiti in precedenza. Inoltre, l’analisi statistica dei risultati ha permesso ai ricercatori di identificare i principali fattori che influenzano la precisione del metodo. Il metodo di screening LC-HRMS ha mostrato livelli di cut-off idonei allo scopo per DON (cut-off 1.150 μg/kg per una concentrazione target di screening di 1.600 μg/kg) e AFB1 (cut-off 1.23 μg/kg per una concentrazione target di screening di 2 μg/kg), che erano comparabili a quelli ottenuti per i saggi immunoenzimatici testati nello stesso esperimento. Per quanto riguarda la precisione del metodo, espressa come deviazione standard relativa che teneva conto della ripetibilità e della variabilità tra i tecnici, per DON e AFB1 sono stati ottenuti rispettivamente  valori del 10 e dell 33%. Un’analisi alla radice indicava che la ragione principale della differenza di precisione tra DON e AFB1 era dovuta alla differenza di grandezza della risposta strumentale LC-HRMS. Poiché la concentrazione di DON era maggiore di quasi tre ordini di grandezza rispetto a quella dell’AFB1, i picchi della LC-HRMS ottenuti per il DON erano ben al di sopra del LOQ dello strumento, mentre per l’AFB1 erano vicini al LOQ, lì dove ci possiamo aspettare una maggiore varianza nelle aree di picco a bassa intensità. Questo è un tipico esempio di compromessi che riguardano i metodi di screening LC-MS multi-micotossine, che coprono vari range di frazioni di massa e che riflettono la naturale presenza delle diverse micotossine. Per estrazioni meno specifiche (cioè per quei processi che utilizzano solo l’estrazione con solvente senza effettuare un clean-up utilizzando tecniche aggiuntive come l’SPE) più materiali contenuti nella matrice possono essere estratti contemporaneamente e possono far diminuire la dimensione del segnale delle micotossine presenti in tracce. Tra le potenzialità offerte dai moderni rilevatori HRMS, la modalità di acquisizione indipendente dei dati (DIA) sta emergendo come un approccio molto versatile per combinare la quantificazione del target e lo screening non mirato. La modalità DIA è utilizzata per eseguire la frammentazione non mirata tramite la suddivisione dell’intero intervallo di massa in un range di successivi ioni precursori fissi m/z,  al fine di coprire l’intera gamma di ioni precursori che ci interessano. Partendo dagli spettri di ioni prodotti possiamo ottenere gli ioni caratteristici per la conferma dell’identità delle micotossine che ci interessano. La combinazione tra scansione completa e MS/MS rende il metodo pienamente conforme ai requisiti stabiliti nel documento SANTE/12089/2016 (CE, 2016), che fornisce i criteri guida per l’identificazione delle micotossine che devono essere prese in considerazione durante la convalidazione del metodo. Tuttavia, la combinazione di numerose scansioni aumenta il tempo del ciclo e porta a perdite di sensibilità, quindi un idoneo equilibrio tra la sensibilità del metodo e il potere di conferma deve essere valutato.

Jia et al. (2019) hanno applicato l’approccio DIA allo screening per la valutazione della presenza di micotossine, e dei loro prodotti di trasformazione, nei nutraceutici provenienti dal tè verde. Per la preparazione del campione è stata utilizzata una procedura di estrazione QuEChERS on-line completamente automatizzata. Per l’analisi LC-MS/HRMS, è stato combinato un evento di scansione completa (m/z 90-900) con venti eventi consecutivi MS/HRMS indipendenti dai dati. Le informazioni quantitative e di conferma relative alle micotossine target sono state ottenute estraendo la massa esatta degli ioni diagnostici selezionati. Inoltre, i cromatogrammi a scansione completa, combinati con spettri di