Oggigiorno la salvaguardia del benessere animale riveste un’importanza cruciale nella filiera di produzione degli alimenti di origine animale, e in particolare nel settore lattiero-caseario. La valutazione del benessere animale deve tenere conto dell’animale stesso e del suo rapporto con l’ambiente. Sebbene un metodo gold standard per la valutazione del benessere animale non sia stato ancora individuato, i criteri ambientali e animal-based devono essere integrati per la creazione di indici specifici (Welfare Quality® 2009).

Uno dei parametri più considerati all’interno dei metodi di valutazione del benessere animal-based è la presenza di stress. I fattori responsabili di stress nell’allevamento dei ruminanti da latte vanno dalle condizioni climatiche, alle tecniche manageriali, alla sanità della mammella, fino all’ordine di parto e la media produttiva. Risposte a questi stressori consistono in cambiamenti comportamentali ed immunitari, e nell’attivazione dei sistemi nervoso autonomo e neuroendocrino. Quest’ultimo può essere valutato attraverso saggi endocrinologici che forniscono una descrizione di tali risposte; in particolare, il cortisolo viene considerato un indicatore utile a monitorare l’attivazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene in risposta allo stress. Il suo rilascio nel corso di un determinato periodo di tempo riflette quello che viene definito “carico allostatico”, ovvero l’effetto cumulativo delle esperienze dell’animale nell’arco sua vita quotidiana.

Il presente studio ha pertanto utilizzato un radioimmunodosaggio già validato per steroidi su varie matrici, tra cui plasma (Neglia et al., 2012), pelo (Peric et al., 2013) e siero di latte bovino (Comin et al., 2015), allo scopo di dosare per la prima volta le concentrazioni di cortisolo nel latte di bufala, e fornire così dei dati preliminari per la calibrazione di futuri biosensori che dosino il cortisolo in maniera non invasiva e da integrare nei normali impianti di mungitura.

Il campionamento di latte è stato eseguito in un’azienda della regione Campania dove sono allevati in totale 950 capi. Sono state casualmente selezionate 71 bufale di razza Mediterranea Italiana a diverso ordine di parto e distanza dal parto. Tutti gli animali venivano munti due volte al giorno ed erano clinicamente esenti da mastite.

In 63 animali dei 71 totali, il campione di latte è stato prelevato individualmente con provette Falcon sterili da 50 mL a partire da un campionatore automatico installato nell’impianto di mungitura. Il campionatore, calibrato dall’associazione allevatori della regione Campania (ARAC) garantiva che il campione di latte fosse rappresentativo dell’intera durata della sessione di mungitura dell’animale.

Un campione integrativo di latte è stato eseguito su 8 dei 71 animali totali. In questo caso il latte individuale è stato prelevato manualmente con provette Falcon sterili da 50 mL in due distinti momenti della sessione di mungitura, ovvero all’inizio e alla fine della sessione stessa. Tutti i campioni sono stati posti in ghiaccio secco (-78 oc) subito dopo il prelievo e trasportati al laboratorio di fisiologia e fisiopatologia della riproduzione dell’Università degli studi di Udine, dove sono stati tenuti a – 20 oc fino al momento delle analisi.

Cinque campioni sono stati selezionati casualmente tra i 63 campionati automaticamente per la prima prova. Dopo scongelamento sono state costituite tre aliquote da 5 mL da processare come latte intero, sgrassato e siero. Per ottenere il latte sgrassato, la seconda aliquota è stata centrifugata per 10 minuti a 2000 x g (4 oc) e la componente grassa surnatante rimossa mediante pipetta Pasteur. La terza aliquota è stata sottoposta a processo di coagulazione per ottenere siero di latte. In breve: sono stati aggiunti 400 µL di caglio (costituito diluendo 60 g di composto commerciale in 250 mL di acqua ultrapura) a 5 mL di latte intero, la cagliata è stata mescolata per 3 minuti a temperatura ambiente e quindi incubata a 37 oc per 30 minuti. Dopo l’incubazione i campioni sono stati sottoposti per due volte a centrifuga (3500 x g per 10 minuti a 4 oc) e separazione della componente grassa.

Nell’ambito della prima prova è stata valutata anche l’efficienza di tre diversi solventi attraverso il test di recupero di cortisolo. Sono stati scelti metanolo (99.8 %), dietiletere (99.8 %) e diclorometano (99.8%). In sintesi, è stato aggiunto un antigene marcato (20 µL, idrocortisone) a 400 µL di ciascun campione preparato come descritto precedentemente, sono stati aggiunti 5 mL di ciascun solvente, e i campioni sono stati mescolati per 5 minuti a temperatura ambiente e centrifugati a 3500 x g per 15 minuti a 4 oc. Le provette sono state dunque tenute a -20 oc e una volta congelate il solvente è stato separato e sottoposto a evaporazione. Il residuo è stato disciolto in 500 µL di tampone (0.05 M, soluzione tampone fosfato, pH 7.5, 0.1% albumina sierica bovina).

Per la seconda prova il resto dei 63 campioni di latte prelevato automaticamente sono stati divisi in due aliquote da processare come latte intero e siero di latte secondo il protocollo descritto precedentemente. Inoltre, 400 µL di latte intero e siero sono stati estratti come segue: sono stati aggiunti 5 mL di metanolo, si è mescolato a temperatura ambiente per 5 minuti e centrifugato (3500 x g) per 15 minuti a 4 oc. Previo congelamento il solvente è stato separato, evaporato e disciolto (500 µL di tampone, 0.05 M, soluzione tampone fosfato, pH 7.5, 0.1% albumina sierica bovina).

Nell’ambito della terza prova, gli otto campioni di latte campionati manualmente all’inizio e alla fine della sessione di mungitura sono stati processati per ottenere siero di latte secondo protocollo descritto precedentemente.

Le concentrazioni di cortisolo sono state determinate mediante radioimmunodosaggio (RIA).

Per i test di validazione sono stati utilizzati diversi pool costituiti a partire da cinque campioni di siero, ciascun pool è stato analizzato in quintuplo. Il test di parallelismo ha determinato la deviazione dalla curva standard di una serie di campioni di siero a concentrazione di cortisolo conosciuta. Questi sono stati preparati mediante diluizioni seriali di siero ad alta concentrazione di cortisolo. È stata utilizzata la regressione lineare per determinare la deviazione di questi campioni dalla curva standard di cortisolo. Il test di recupero è stato condotto per valutare la risposta del dosaggio a crescenti concentrazioni di cortisolo aggiunto a campioni di siero di latte a bassa concentrazione. La percentuale di recupero è stata calcolata come segue:

[(cortisolo misurato in campioni marcati) / (cortisolo misurato in campioni non marcati + cortisolo aggiunto)] * 100

La sensibilità della curva è stata determinata a partire dalla concentrazione dell’ormone risultante da una deviazione del marcato di almeno il doppio della deviazione standard rispetto al legame massimo. La precisione è stata determinata mediante dosaggi multipli e mediante i coefficienti di variazione inter e intra-saggio.

L’analisi statistica è stata condotta usando SPSS (versione 28.0) per Windows 10. Il test T di Student ha paragonato le concentrazioni di cortisolo tra le diverse formulazioni di latte e tra i due momenti di campionamento; il test di correlazione di Pearson ha valutato la relazione tra le diverse formulazioni di latte.

Nell’ambito della prima prova il metanolo si è rivelato il solvente più efficiente coi seguenti tassi di recupero: 58.89 ± 3.47%, 59.09 ± 4.03% and 69.88 ± 1.43% (per latte intero, sgrassato e siero rispettivamente).

Le concentrazioni di cortisolo (pg/mL) dosate nelle tre formulazioni di latte coi tre solventi testati sono rappresentate in figura 1.

Figura 1. Concentrazioni di cortisolo (pg/mL) dei 5 campioni testati nella prima prova come latte intero, sgrassato e siero, estratti con diclorometano, dietiletere e metanolo.


In base a quanto evidenziato nella prima prova, è stato scelto il metanolo come solvente per la seconda prova (figura 2).

Figura 2. Concentrazioni di cortisolo (pg/mL) dei 63 campioni testati nella come latte intero estratto, siero estratto e siero.

Non sono state evidenziate differenze statisticamente significative tra le 3 formulazioni testate; mentre correlazione statisticamente significativa (p < 0.001, coefficiente di correlazione + 0.51) è emersa tra le concentrazioni di cortisolo di latte intero estratto e siero.

Le concentrazioni sieriche di cortisolo dosate nella terza prova sono riportate in figura 3. Non è emersa differenza significativa tra le due finestre di campionamento (p > 0.05).

Figura 3. Concentrazioni di cortisolo (pg/mL) dosate nel siero di latte campionato a inizio e fine sessione di mungitura. La differenza è stata calcolata come [concentrazione iniziale – concentrazione finale]; la percentuale di variazione come [(concentrazione iniziale – concentrazione finale) / concentrazione iniziale] *100

Il test di parallelismo tra la curva di diluizione e quella standard ha indicato che il cortisolo dosato e quello standard hanno reagito ugualmente all’anticorpo, evidenziando una relazione altamente significativa tra la concentrazione attesa di cortisolo e quella dosata nel siero (R2 = 0.99). Il tasso di recupero è stato in media del 104.4 ± 6.1 %, la sensibilità si è attestata sui 16.8 pg/mL, con coefficienti di variazione del 7.6 % e 12.7 % (intra ed inter-saggio rispettivamente).

La valutazione della concentrazione di cortisolo in varie matrici biologiche rappresenta uno dei principali strumenti di valutazione dello stress. In particolare, il cortisolo è stato usato per studiare la differenza tra sistema di mungitura tradizionali ed automatici (Gygax et al., 2006), o le caratteristiche comportamentali delle vacche in post-partum (Fukasawa e Tsukada 2010). Il latte è una matrice di particolare interesse poiché la mungitura è un processo eseguito di routine e permette un campionamento di tipo non invasivo, direttamente in sala e in linea ai controlli ufficiali, senza manipolazioni ulteriori dell’animale.

Il presente studio si è pertanto proposto di validare per la prima volta un radioimmunodosaggio per il cortisolo nel latte di bufala. Questo permetterebbe di descrivere le concentrazioni fisiologiche di cortisolo nella specie bufalina, con l’obbiettivo pratico finale di calibrare un biosensore che misuri automaticamente il cortisolo nel latte di bufala, in linea con la normale routine di mungitura. Sono state considerate due variabili che potessero interferire con l’attività del sensore: la formulazione di latte (matrice) oggetto di dosaggio e il momento stesso del dosaggio.

Due delle tre matrici analizzate hanno mostrato criticità legate alla scarsa versatilità nei momenti di preparazione e successivo utilizzo dei campioni. L’alto contenuto in grasso del latte di bufala (8.00 %) ha infatti inciso sull’analisi delle matrici latte intero e sgrassato. Il siero invece si è rivelato di grande interesse, rimuovendo le interferenze dovute alle componenti proteica e lipidica e risultando da un processo di coagulazione che si è confermato essere efficace e rapido anche nel latte bufalino. Le concentrazioni di cortisolo dosate nel siero hanno inoltre evidenziato una correlazione significativa con quelle del latte intero estratto con metanolo (che si è rivelato il solvente più efficiente). Pertanto, anche per quanto riguarda la specie bufalina (simili conclusioni erano state tratte anche per il progesterone nel latte vaccino da Comin et al. nel 2005), è stato possibile indicare il siero di latte come matrice più stabile e versatile per il dosaggio del cortisolo.

La seconda variabile analizzata è legata alla variazione della composizione del latte nell’arco di una singola sessione di mungitura (in termini di tenore in grasso, che si caratterizza per essere più alto all’inizio della sessione) e, di conseguenza, alla potenziale interferenza dell’alto tenore lipidico (proprio del latte di bufala) sull’affidabilità del biosensore. In base ai nostri dati è possibile affermare che le concentrazioni di cortisolo dosate nel siero non sono condizionate dalle variazioni del tenore in grasso nell’arco della sessione di mungitura, non sono infatti emerse differenze tra i dosaggi sui campioni prelevati all’inizio e alla fine. In particolare, la variazione è stata sempre inferiore a 0.1 ng/mL e sempre a favore del momento di campionamento inziale.

Infine, il radioimmunodosaggio utilizzato ha mostrato alta precisione, sensibilità e specificità anche nella determinazione del cortisolo nel siero di latte di bufala, escludendo qualsiasi possibile interferenza dovuta alla matrice. I livelli descritti risultano pertanto fruibili nell’ottica futura della calibrazione di un biosensore da integrare nell’impianto di mungitura, che dosi il cortisolo real-time e in maniera non invasiva.

Sinossi di: Cotticelli, A., Verde, M.T., Matera, R., Pividori, I., Prandi, A., Neglia, G., Peric, T., 2022. Validation of a radioimmunoassay method for cortisol in buffalo milk whey. A preparatory step for future sensor technology. Italian Journal of Animal Science 21, 1622–1631. doi.org/10.1080/1828051X.2022.2147868

Progetto STRABUF-Strategie per il miglioramento della redditività dell’allevamento bufalino.

Progetto TRANSFER-Tecnologie innovative per la realizzazione di una smart farm-ing nel settore bufalino.

 

Bibliografia

Welfare Quality ®. 2009. Welfare Quality ® assessment protocol for cattle. Lelystad: Welfare Quality ® Consortium.

Neglia G, Vecchio D, Russo M, Di Palo R, Pacelli C, Comin A, Gasparrini B, Campanile G. 2012. Efficacy of PGF(2a) on pre-ovulatory follicle and corpus luteum blood flow. Reprod Domest Anim. 47(1):26–31.

Peric T, Comin A, Corazzin M, Montillo M, Cappa A, Campanile G, Prandi A. 2013. Short communication: hair cortisol concentrations in Holstein-Friesian and crossbreed F1 heifers. J Dairy Sci. 96(5):3023–3027.

Comin A, Renaville B, Marchini E, Maiero S, Cairoli F, Prandi A. 2005. Technical note: direct enzyme immunoassay of progesterone in bovine milk whey. J Dairy Sci. 88(12): 4239–4242.

Gygax L, Neuffer I, Kaufmann C, Hauser R, Wechsler B. 2006. Milk cortisol concentration in automatic milking systems compared with auto-tandem milking parlors. J Dairy Sci. 89(9):3447–3454.

Fukasawa M, Tsukada H. 2010. Relationship between milk cortisol concentration and the behavioral characteristics of postpartum cows introduced to a new group. Anim Sci J. 81(5):612–617.