Negli ultimi anni c’è stata una crescente consapevolezza del ruolo chiave svolto dal bufalo (Bubalus bubalis) come preziosa fonte proteica, in particolare per i paesi tropicali e subtropicali, portando ad un notevole aumento a livello mondiale della popolazione di bufali, attualmente stimata in 207 milioni di capi.

Il bufalo è un animale stagionale a fotoperiodo negativo, mostra prestazioni riproduttive migliori durante i mesi caratterizzati da una diminuzione della durata del giorno. La stagionalità riproduttiva rappresenta in questo momento il principale vincolo dell’allevamento bufalino, portando alla discontinuità della fornitura di latte nel corso dell’anno. In Italia, poiché il modello di parto naturale è opposto alla domanda del mercato del latte, viene utilizzata la strategia di accoppiamento fuori stagione.

Questa tecnica consente senza dubbio una distribuzione più uniforme dei parti durante tutto l’anno, ma si registra una maggiore incidenza di mortalità embrionale durante la stagione non riproduttiva. La maggiore incidenza di mortalità embrionale è in parte dovuta alla ridotta funzione luteale e quindi alla ridotta secrezione di progesterone, che è correlata al ritardo della crescita dell’embrione ed è associata a cambiamenti trascrittomici e proteomici, con conseguente ostacolo all’attecchimento dell’embrione.

Tuttavia, la mortalità embrionale durante la stagione non riproduttiva nel bufalo mediterraneo italiano è causata anche dalla ridotta competenza allo sviluppo degli oociti, come chiaramente indicato dai tassi più bassi di divisione e formazione di blastocisti dopo la fecondazione in vitro. Nelle manze di bufalo Murrah la qualità oocitaria più bassa registrata durante la stagione non riproduttiva era associata a ridotti livelli intra-follicolari di estradiolo e IGF-1.

L’oocita acquisisce la competenza evolutiva, cioè la capacità di essere fecondato e di svilupparsi in embrione, durante l’ultima fase di crescita che è strettamente coordinata con quella del follicolo. L’acquisizione della competenza allo sviluppo dell’oocita è un processo graduale che coinvolge un’espressione spazio-temporale modulata con precisione da vari geni.

È noto che i microRNA (MiRNA) svolgono un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica. È interessante notare che recentemente sono state dimostrate variazioni stagionali nel contenuto di miRNA e nel profilo trascrittomico sia negli oociti di bufalo che nelle cellule follicolari. I cambiamenti dipendenti dalla stagione nell’espressione genica probabilmente determinano una diversa abbondanza di metaboliti, influenzando di fatto il profilo metabolico del follicolo. Pertanto, la conoscenza del profilo metabolico del follicolo è fondamentale per svelare le cause della ridotta competenza oocitaria durante la stagione non riproduttiva.

I metaboliti sono gli indicatori più affidabili dei tratti fenotipici, come prodotti intermedi e/o finali delle vie metaboliche. La metabolomica consente un’ampia identificazione dei metaboliti a basso peso molecolare, che sono i prodotti a valle dell’espressione del genoma, del trascrittoma e del proteoma presenti nei fluidi biologici, nelle cellule e nei tessuti, e può fornire un quadro delle variazioni dinamiche in risposta alle variazioni ambientali o fattori genetici.

Attualmente sono disponibili diverse tecniche per la metabolomica, quali la gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier, la spettroscopia Raman e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, che è stata considerata una delle tecniche più avanzate per ricerca sui fluidi biologici.

Il microambiente follicolare in cui cresce l’oocita influenza sicuramente la competenza dell’oocita stesso. L’analisi metabolomica del fluido follicolare è stata effettuata nei bovini consentendo l’identificazione di alcuni marcatori predittivi per la competenza dello sviluppo dell’oocita. Inoltre, sono state registrate variazioni nel profilo degli acidi grassi totali e degli aminoacidi nel liquido follicolare delle vacche rispetto alle manze, rispettivamente con bassa e alta fertilità.

Per quanto ne sappiamo, la metabolomica non è stata finora applicata alla riproduzione nelle bufale. Pertanto, è stato effettuato un esperimento dal Dipartimento di Medicina Veterinaria e Produzioni Animali della Federico II, con lo scopo di valutare l’effetto stagionale sul profilo metabolomico del follicolo ovarico nella bufala mediterranea italiana per svelare le cause della ridotta competenza durante la stagione non riproduttiva. Campioni di fluido follicolare, cellule follicolari, cellule del cumulo e oociti sono stati raccolti da ovaie derivate dal macello durante la stagione riproduttiva buona e cattiva e analizzati mediante risonanza magnetica nucleare 1H.

I campioni sono stati raccolti nel mese di ottobre, cioè durante la stagione buona e nel mese di gennaio, cioè durante la stagione cattiva, per un totale di 8 repliche (4/stagione). Le ovaie sono state raccolte presso un macello locale (Real Beef srl, Flumeri (AV), Italia), nel rispetto delle normative nazionali sull’igiene alimentare, da bufale mediterranee italiane multipare cicliche (in media 40 a stagione), allevate in regime di nutrizione controllata e ospitate all’interno di stalle in allevamenti intensivi locati nella provincia di Caserta. L’età e il peso degli animali erano rispettivamente di 4,8 ± 0,6 anni e 547,2 ± 14,3 kg.

L’attività ovarica è stata valutata da due esami clinici effettuati a distanza di 12 giorni prima della macellazione, per individuare la presenza di un follicolo maggiore di 1 cm e/o di un corpo luteo sull’ovaio. Le ovaie sono state trasportate al laboratorio entro 4 ore dalla macellazione in soluzione fisiologica salina integrata con 150 mg/L di kanamicina a 30-35 C. Durante ogni stagione sono state effettuate quattro repliche per raccogliere il liquido follicolare, cellule follicolari, cellule del cumulo e oociti. In breve, il liquido follicolare è stato aspirato, separato dalle cellule follicolari, e metà dei complessi cumulo oocita (COC) trovati sono stati denudati per poter raccogliere sia gli oociti che le cellule del cumulo; quindi questi campioni sono stati conservati a – 80° C fino alle analisi. I restanti COC sono stati maturati in vitro, fecondati in vitro, per valutare la competenza allo sviluppo.

I risultati hanno mostrato una chiara separazione in classi stagionali, e metaboliti differenzialmente abbondanti tra le stagioni. Sono state registrate differenze stagionali nel contenuto di metaboliti in tutti i componenti analizzati, suggerendo che la ridotta competenza degli oociti durante la stagione cattiva potrebbe essere collegata all’alterazione di diverse vie metaboliche.

L’analisi dell’arricchimento del percorso ha rivelato che le differenze nei metaboliti tra le stagioni erano collegate al glutatione, alla generazione di energia, al metabolismo degli aminoacidi e alla biosintesi dei fosfolipidi. Il lavoro in oggetto consente l’identificazione di potenziali marcatori di competenza positivi nel fluido follicolare come glutatione, glutammato, lattato e colina, e marcatori negativi come leucina, isoleucina e β-idrossibutirrato. Questi risultati costituiscono una base importante per sviluppare potenziali strategie per ottimizzare l’ambiente follicolare e il terreno di maturazione in vitro per migliorare la competenza degli oociti durante la stagione cattiva.

Curiosamente, la maggior parte dei metaboliti mostra una diminuzione nel fluido follicolare della stagione cattiva rispetto alla buona, ad eccezione di b-idrossibutirrato (bHB), leucina e isoleucina. Di particolare interesse è stato il contenuto più elevato di bHB durante la stagione cattiva nel fluido follicolare, che era il metabolita con la variazione più elevata tra le due stagioni. Questo risultato è in accordo con i livelli di acidi grassi totali non esterificati (NEFA) e acidi grassi saturi palmitico e stearico precedentemente riportati durante la stagione cattiva. Vale la pena sottolineare che la stagione cattiva è iniziata in inverno quando le temperature erano basse, giocando un ruolo additivo nel fotoperiodo.

È probabile che, a causa della loro origine tropicale, i bufali non si adattino bene alle temperature fredde e, soprattutto il passaggio dai periodi miti a freddi può portare ad una termoregolazione inadeguata e ad un bilancio energetico negativo (NEB). La fase di NEB provoca la mobilitazione del grasso corporeo e delle proteine muscolari per fornire energia alternativa a tessuti e precursori per mantenere i livelli di glucosio entro i livelli basali, con conseguente aumento dei livelli di NEFA e bHB nel sangue.

Nei bovini da latte sottoposti a NEB esiste una correlazione tra i livelli plasmatici e follicolari di glucosio, NEFA, bHB, urea e colesterolo totale. È stato ipotizzato che le condizioni metaboliche del siero che si verificano durante la NEB possono inficiare l’ambiente follicolare e può influenzare negativamente la competenza dell’oocita. In effetti, livelli di glucosio bassi, così come livelli alti di urea e NEFA, in particolare acido saturi quali palmitico e stearico, nel fluido follicolare sono potenzialmente tossici per gli oociti bovini.

Inoltre, è stata ipotizzato un ulteriore effetto tossico del bHB in condizioni ipoglicemiche. L’aumentato contenuto di bHB trovato nello studio attuale e i livelli elevati di NEFA totali, nonché acido palmitico e stearico nei campioni di fluido follicolare, suggeriscono una condizione di scarsità energetica nei bufali durante la stagione cattiva, che porta ad un bilancio energetico negativo.  Le concentrazioni più elevate di leucina e isoleucina nel fluido follicolare durante la stagione cattiva possono collegarsi ad una condizione di NEB e di conseguenza alla mobilitazione delle proteine, dato che questi aminoacidi sono marcatori del turnover proteico.

In contrasto, non sono stati osservati cambiamenti stagionali nei livelli di urea e glucosio nel fluido follicolare. Tuttavia, è stata osservata una quantità ridotta di glucosio nelle cellule follicolari, cellule del cumulo e oociti durante la stagione cattiva. I cambiamenti nella concentrazione di glucosio, lattato e ATP sono certamente indicativi di un impatto stagionale sul metabolismo energetico del follicolo. La glicolisi rappresenta il principale percorso energetico del COC, con il glucosio come principale substrato per le cellule del cumulo e piruvato, lattato e ATP come principali prodotti finali.

Infatti, le cellule del cumulo sono principalmente glicolitiche, mentre gli oociti si basano principalmente sull’ossidazione mitocondriale del piruvato per la produzione di ATP. Le cellule del cumulo assorbono il glucosio dall’ambiente follicolare, metabolizzandolo in piruvato e trasferendolo attraverso le gap-junction all’oocita. I livelli ridotti di glucosio nelle cellule follicolari, cellule del cumulo e oocita sono in linea con lo stato catabolico ipotizzato negli animali durante la stagione cattiva.

Tuttavia, livelli più bassi di glucosio e livelli di lattato più elevati rilevati anche in cellule follicolari e cellule del cumulo, suggeriscono un aumento dell’attività glicolitica anaerobica durante la stagione cattiva; questa ipotesi non è supportata dalla diminuzione della concentrazione di lattato nel fluido follicolare. Lattato, che normalmente è abbondante nel liquido follicolare e tratto riproduttivo, modula lo stato redox citosolico. L’importante ruolo svolto dal lattato nel metabolismo del follicolo e dello stato redox suggerisce che le diverse concentrazioni di lattato osservate tra le stagioni indicano un metabolismo energetico interrotto.

La più grande quantità di ATP osservata durante il bilancio energetico negativo nelle cellule follicolari, cellule del cumulo e oocita potrebbe essere una conseguenza dell’aumento del livello di metaboliti presenti nel liquido follicolare (NEFA e corpi chetonici), a causa del presunto bilancio energetico negativo e assorbimento da parte del follicolo. Per soddisfare i requisiti del fabbisogno energetico, è necessaria una quantità adeguata di ATP negli oociti e negli embrioni fondamentale per lo sviluppo, influenzando la sintesi delle proteine e degli acidi nucleici, ed è stato suggerito come marcatore per lo sviluppo potenziale degli embrioni di topo e bovino.

Tuttavia, l’associazione tra contenuto di ATP e lo sviluppo della competenza dell’oocita è controversa, contraddittoria ai risultati in specie diverse. L’associazione tra la competenza allo sviluppo degli oociti in relazione al livello di lipidi intracellulari e agli alti livelli di ATP, richiede ulteriori indagini. Nel complesso, i risultati attuali dello studio indicano certamente una modifica del microambiente dell’oocita in via di sviluppo, che può essere derivato da modifiche legate al siero durante il bilancio energetico negativo della stagione cattiva, che si riflettono nel liquido follicolare. L’ipotesi che la competenza dell’oocita diminuita nelle bufale durante la stagione sfavorevole è associata al bilancio energetico negativo e stress metabolico richiede senza dubbio ulteriore indagine.

I risultati di questo studio hanno mostrato anche una differenza stagionale tra i profili di aminoacidi e peptidi a livello follicolare. Tra questi il glutatione (GSH) e i suoi precursori, la cisteina e glutammato, così come la serina, coinvolta nel percorso di sintesi della cisteina, sono di particolare interesse a causa del ruolo noto del GSH nella difesa cellulare antiossidante e nello sviluppo degli oociti. Durante la stagione cattiva, tutti questi metaboliti sono risultati meno abbondanti nel fluido follicolare, e anche i livelli di GSH erano ridotti nelle cellule follicolari.

Il GSH contribuisce alla decondensazione degli spermatozoi e alla formazione del pronucleo maschile dopo la fecondazione. Oociti in maturazione di diversi specie, compreso il bufalo, sono in grado di sintetizzare GSH durante la maturazione per creare un pool di riserva di GSH che protegge gli embrioni durante lo sviluppo iniziale fino all’attivazione del genoma embrionale. Nel nostro studio, i livelli ridotti di serina, cisteina e glutammato nel fluido follicolare durante la stagione cattiva, si riflettono in un ridotto contenuto di GSH, suggerendo che l’oocita cresce in un ambiente carente di difesa antiossidante, il quale può spiegare la competenza oocitaria inferiore.

L’elevata concentrazione intraoocitaria di GSH durante la stagione cattiva osservata in questo studio non era prevista, soprattutto perché il GSH nell’oocita sembra essere un indicatore di competenza di sviluppo dell’oocita e maturazione citoplasmatica. Il contenuto più elevato di GSH negli oociti durante la stagione cattiva potrebbe essere correlato al suggerito apporto di nutrienti più elevato a livello follicolare a causa dell’aumento dei livelli di NEFA e b-HB, che è in linea con l’aumento del contenuto di ATP, suggerendo un elevato stato energetico o diminuzione del consumo di energia da parte dell’oocita.

Tuttavia, non si può escludere che durante la stagione cattiva, gli oociti che crescono in un ambiente privo di antiossidanti aumentano la sintesi di GSH, con conseguente livello inferiore di cisteina nel fluido follicolare per contrastare lo stress ossidativo. Un’analisi dei livelli di ROS aiuterebbe sicuramente a capire i cambiamenti osservati  in merito  ai livelli di GSH intracitoplasmatico dell’oocita durante il bilancio energetico negativo.

Tuttavia, l’attuale set di dati dimostra chiaramente che durante la stagione cattiva, il metabolismo del GSH e dei suoi principali precursori è influenzato a diversi livelli all’interno del follicolo, come confermato dall’arricchimento del percorso di analisi, che possono influenzare la competenza degli oociti. Per caratterizzare meglio lo stato ossidativo del follicolo, sono stati analizzati marker enzimatici (SOD, GSH-Px e CAT) e TAC nel fluido follicolare. La ridotta attività CAT riscontrata nella stagione cattiva è in linea con l’ipotesi di una ridotta difesa antiossidante nell’ambiente follicolare.

In un altro studio, la diminuzione dell’attività di GSH/catalasi e l’aumento dell’attività SOD nel liquido follicolare umano hanno dimostrato essere marcatori della senescenza degli oociti. La mancanza di variazioni stagionali negli altri antiossidanti enzimatici (SOD e GSH-Px) osservato nel presente studio è in contrasto con il precedente studio sugli esseri umani che ha riportato un risultato positivo (GSH-Px) e negativo (SOD) in associazione con la competenza dell’oocita.

Comunque, il modello di attività SOD nel nostro studio concorda con uno studio condotto nei bufali egiziani, nei quali non c’erano differenze stagionali. Inoltre, l’attività SOD nel fluido follicolare di bufalo non variava in relazione alla competenza oocitaria, mentre i livelli di GSH erano ridotti nel liquido follicolare corrispondente a meno oociti competenti. Il livello di TAC inaspettatamente più alto registrato durante la stagione cattiva, sembra essere in contrasto con la diminuzione dell’attività del CAT, insieme ai livelli ridotti di GSH.

Tuttavia, un simile andamento stagionale dell’attività dei TAC è stato riportato in precedenza in uno studio sui bufali egiziani. È interessante notare che i livelli di TAC più elevati nel fluido follicolare umano, associati a ridotta competenza oocitaria, sono stati interpretati come il risultato della difesa antiossidante follicolare in risposta allo stress ossidativo persistente. Pertanto, prendendo in considerazione i risultati, ipotizziamo che altri antiossidanti possano essere all’interno del follicolo durante la stagione cattiva come compensazione in risposta all’aumento dello stress ossidativo.Senza dubbio, è stato osservato un effetto sul bilancio antiossidante all’interno del follicolo, il quale potrebbe contribuire a ridurre la competenza oocitaria durante la stagione cattiva.

Per quanto riguarda gli altri aminoacidi, i nostri risultati sono concordanti con quelli di un precedente studio sui profili aminoacidici di liquido follicolare nei bovini, in cui i livelli di glutammato erano più alti e quelli di leucina e isoleucina erano inferiori nel fluido follicolare di oociti competenti rispetto a non competenti. È interessante notare che alcuni degli aminoacidi che sono considerati marcatori predittivi di competenza degli oociti nei bovini, come glutammato, leucina e isoleucina, possono anche essere candidati marcatori nel bufalo in base a dati dello studio attuale.

I livelli follicolari più bassi di prolina, la lisina e la serina trovate nel nostro studio durante la stagione cattiva sono invece in contrasto con i dati precedenti relativi ai bovini, dove sono diminuiti i livelli di lisina e la prolina nel fluido follicolare era correlata all’aumento della competenza degli oociti e non è stata trovata una relazione con i livelli di serina.

Tuttavia, negli esseri umani, l’aumento dei livelli di prolina follicolare era correlato al successo della gravidanza, che è in accordo con i livelli più alti di prolina e una maggiore fertilità, registrati durante la stagione buona nell’attuale studio. Aminoacidi nel fluido follicolare bovino che erano altamente predittivi per la competenza degli oociti, come l’alanina e la glicina, non lo erano nel nostro studio, il che dimostra l’importanza degli studi specie-specifici.

Un altro dato interessante dello studio attuale è stata la minore concentrazione di colina e i suoi derivati fosfocolina e glicerofosfocolina. Questi dati sono in linea con i precedenti negli esseri umani, dove una riduzione dei livelli di colina, fosfocolina e glicerofosfocolina nel fluido follicolare erano correlate a oociti che non si sono scissi dopo la fecondazione in vitro.

Cambiamenti di stagione nei metaboliti della colina sono stati osservati anche nelle cellule somatiche, mostrando modelli opposti in cellule follicolari e cellule del cumulo, probabilmente correlati a funzioni specifiche dei tipi cellulari. Le cellule del cumulo sono capaci di fosforilare rapidamente la colina nei suoi derivati, la quale può essere assorbita dall’oocita per esigenze energetiche. In ogni caso, questi cambiamenti sono rilevanti poiché la colina e la fosfocolina sono i precursori della fosfatidilcolina e sono componenti chiave delle membrane biologiche. L’importanza di questi metaboliti è confermato dal compromesso sviluppo follicolare e maturazione oocitaria in topi transgenici con alterazione della produzione di fosfatidilcolina.

L’analisi del percorso metabolico ha rivelato che il metabolismo del GSH e i suoi precursori sono stati influenzati dalla stagione a molti livelli all’interno del follicolo. Erano presenti effetti stagionali anche nella biosintesi della fosfatidilcolina e nella degradazione della valina/leucina/isoleucina sia nel fluido follicolare che nelle cellule somatiche. Inoltre, le vie metaboliche coinvolte nel metabolismo energetico erano colpite principalmente nelle cellule somatiche e negli oociti, questi ultimi mostrano anche alterazioni nel metabolismo dell’azoto, degli aminoacidi e del folato.

In conclusione, questo studio dimostra una composizione distinta di metaboliti nelle componenti follicolari analizzate nel bufalo tra stagione buona e cattiva. Le differenze stagionali nei metaboliti suggeriscono che durante la stagione cattiva si verificano diverse alterazioni delle vie metaboliche, come il metabolismo del GSH e la capacità antiossidante, metabolismo energetico, biosintesi dei fosfolipidi e, metabolismo aminoacidico, che può essere collegato alla ridotta competenza degli oociti. Inoltre, sono stati identificati potenziali marcatori di competenza oocitaria nel fluido follicolare; tra questi, i potenziali marcatori positivi erano GSH, glutammato, lattato e coline, mentre i marcatori negativi sono leucina, isoleucina e bHB.

Le marcate differenze tra le due stagioni possono suggerire potenziali strategie per ottimizzare l’ambiente follicolare e migliorare la competenza degli oociti raccolti durante la stagione cattiva. Tuttavia, studi futuri dovrebbero indagare sulle differenze osservate nei meccanismi ed è necessaria una quantificazione dei metaboliti. Inoltre, la valutazione dei livelli di ROS negli oociti aiuterebbe a comprendere la risposta oocitaria alla condizione subottimale nella stagione cattiva.

A cura di Riccardo Esposito & Federica Piscopo

Sinossi dell’articolo: Seasonal variations in the metabolomic profile of the ovarian follicle components in Italian Mediterranean Buffaloes. Michal Andrzej Kosior, Riccardo Esposito, Natascia Cocchia, Federica Piscopo, Valentina Longobardi, Nunzio Antonio Cacciola, Giorgio Antonio Presicce, Giuseppe Campanile, Hilde Aardema, Bianca Gasparrini. Theriogenology Volume 202, May 2023, Pages 42-50 www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X23000651

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