Analisi del cortisolo in diverse matrici. Nuove frontiere per valutare lo stress nella bufala da latte

Introduzione

Oggigiorno, il benessere animale negli allevamenti da latte rappresenta un fattore determinante, al fine di proteggere gli animali da condizioni inadeguate e migliorare la qualità degli alimenti di origine animale. È quindi fondamentale poter interpretare il loro comportamento, necessità e capacità cognitive (Nawroth et al. 2019) per soddisfare i loro requisiti e ridurre situazioni di stress.

Lo stress è una condizione animale derivante dall'azione di uno o più fattori, di origine esterna o interna (Bova et al. 2014). Diverse condizioni fisiologiche e patologiche possono essere responsabili dell'alterazione dell'omeostasi negli animali. L'ordine di parto e la fase di lattazione sono fattori fisiologici; come tali, possono influenzare il profilo metabolico (Kuczyńska et al. 2021), la produzione di latte e il conteggio delle cellule somatiche (Sabek et al. 2021), e l'equilibrio acido-base (Walter et al. 2022) nei bovini da latte.

In particolare, i processi fisiologici che le vacche mettono in atto per adattarsi alla fase della lattazione comportano la riduzione della competenza immunitaria, il bilancio energetico negativo, l'ipocalcemia, le risposte infiammatorie e lo stress ossidativo (Trevisi e Minuti, 2018).

In modo simile, la produzione di latte può rappresentare un carico fisiologico per i ruminanti da latte e può essere associata all'attivazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA) (Otten et al. 2023).

Difatti, la produzione di latte mette alla prova il metabolismo e la salute delle vacche da latte (Gross e Bruckmaier, 2019) poiché avvengono complessi processi di adattamento per consentire il mantenimento dell'omeostasi energetica e nutrizionale degli animali, al fine di soddisfare i requisiti della ghiandola mammaria, metabolicamente prioritaria, durante la prima fase della lattazione (van Knegsel et al. 2014).

Il cortisolo è un glucocorticoide, a causa del suo ruolo sfaccettato nella risposta fisiologica allo stress, è il biomarker fisiologico principale per molti cambiamenti fenotipici e metabolici negli animali associati all'attivazione dell'asse HPA (Hellhammer et al. 2009).

Sebbene il cortisolo plasmatico sia comunemente utilizzato per valutare le risposte acute allo stress, il prelievo di sangue può alterare i risultati a causa della risposta alle manipolazioni e al contenimento. Il latte, validato recentemente come alternativa al sangue, offre una valutazione a breve termine dell'attività dell'asse HPA, mentre il pelo risulta utile per analizzare i livelli di cortisolo a lungo termine.

Dunque, questo studio ha mirato ad esaminare l'influenza dell'ordine di parto, della fase di lattazione e del livello produttivo sulle concentrazioni di cortisolo in diverse matrici biologiche nelle bufale mediterranee italiane, e a valutare quale matrice potesse caratterizzarsi per un promettente potenziale predittivo. 

Materiali e metodi

Le bufale da latte di razza Mediterranea Italiana (Bubalus bubalis) utilizzate in questo studio erano allevate in un'azienda lattiero-casearia del sud Italia nella quale erano presenti in totale 950 bufale. Sono state selezionate bufale pluripare (n = 30) e bufale primipare (n = 38) mantenute in stalle con pavimento in cemento. Le bufale venivano munte regolarmente due volte al giorno (mattina e pomeriggio) in una sala di mungitura a spina di pesce. 

All'inizio della sperimentazione, un'area di 10 cm² è stata rasata in tutti gli animali nella regione prescapolare sinistra. Dopo 50 giorni, sono stati prelevati contemporaneamente tre tipi di campioni (sangue, latte e pelo ricresciuto) da ciascun animale in diverse fasi di lattazione e di diverso livello produttivo.

Le caratteristiche qualitative del latte includevano produzione di latte, contenuto in grasso, proteine e lattosio (espressi come percentuale giornaliera), conteggio delle cellule somatiche (SCC, trasformato logaritmicamente in score delle cellule somatiche (SCS)), produzione di latte equivalente maturo (EMY), contenuto in grasso equivalente maturo (EFC) e contenuto in proteine equivalentemente maturo (EPC).

Sono stati infine calcolati il latte corretto per l'energia (ECM) e il latte equivalente maturo corretto per l'energia (eECM) secondo le seguenti equazioni:

ECM=produzione di latte × + 1

eECM=dEMY × + 1

I campioni di latte sono stati raccolti mediante Falcon sterili, ogni singolo campione è rappresentativo dell'intera mungitura di ciascuna bufala, in più per ogni campione sono state costituite 2 aliquote, una è stata utilizzata come latte intero per l'estrazione, mentre l'altra è stata destinata all'ottenimento del siero del latte. 

Il sangue (10 ml) è stato prelevatto dalla vena mammaria in provette Vacutainer (con litio ed eparina). 

Per le analisi è stato utilizzato solo pelo ricresciuto, dato che un primo prelievo è stato effettuato 50 giorni prima della raccolta dei campioni e quel pelo è stato scartato (Meyer e Novak 2012). Pertanto, i campioni raccolti per le analisi rappresentavano le concentrazioni di steroidi circolanti integrate nei 50 giorni precedenti (Meyer e Novak, 2012).

Le concentrazioni di cortisolo sono state misurate in latte intero estratto, siero di latte, pelo e plasma utilizzando un radioimmunodosaggio in-house (Cotticelli et al. 2022). 

In base allo stadio di lattazione, le bufale sono state assegnate a tre classi (Matera et al. 2021): classe C (fase catabolica della lattazione, tra 60 e 90 giorni in mungitura (GIM), n = 23), classe A1 (prima fase anabolica, da 91 a 150 GIM, n = 19) e classe A2 (seconda fase anabolica, oltre 150 GIM; n = 26). Inoltre, gli animali sono stati suddivisi in base ai loro livelli produttivi (4 classi), in base ai percentili di EMY (kg) ed eECM (Tabella 1).

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS (29.0.1.0) per Windows 10 (SPSS Inc., Chicago, IL). Le possibili correlazioni tra le concentrazioni di cortisolo delle quattro matrici e i parametri del latte equivalente maturo sono state studiate utilizzando la correlazione di Spearman.

Le concentrazioni di cortisolo tra le due formulazioni di latte sono state confrontate utilizzando il test dei ranghi con segno di Wilcoxon per campioni correlati. Il test di Kruskal-Wallis è stato utilizzato per confrontare le concentrazioni di cortisolo delle quattro matrici in base a stadio di lattazione, livello produttivo e ordine di parto. Il potenziale predittivo delle matrici è stato testato includendo le concentrazioni di cortisolo nel siero, nel latte intero estratto e nel plasma in un modello di regressione lineare (previa trasformazione logaritmica).

Risultati

I giorni in mungitura e l'età delle bufale da latte coinvolte in questo studio, insieme ai parametri qualitativi e quantitativi del latte registrati, sono riportati nella Tabella 2.

La distribuzione delle concentrazioni di cortisolo nelle quattro matrici analizzate nel presente studio è riportata nella Tabella 3. 

L'ordine di  parto non ha mostrato effetto significativo sulle concentrazioni di cortisolo per ciascuna delle quattro matrici, con valori simili nel siero, nel latte intero estratto, nel pelo e nel plasma (p > 0,10).

L'analisi dell'influenza della fase di lattazione (Figura 1) sulle concentrazioni di cortisolo (pg/mL) nel latte intero estratto ha rivelato concentrazioni significativamente più elevate (p < 0,05) durante la fase catabolica rispetto alla seconda fase anabolica. Una tendenza simile è stata osservata anche nel siero, anche se in questo caso i valori non hanno raggiunto la significatività statistica (p < 0,10). 

Le concentrazioni di cortisolo non sono risultate differenti tra latte intero estratto e siero (p > 0,10, figura 2), con valori mediani di 340,65 pg/mL (siero) e 338,53 pg/mL (latte intero estratto).

In modo simile, le concentrazioni plasmatiche di cortisolo sono risultate più elevate durante la fase catabolica e la prima fase anabolica rispetto alla seconda fase anabolica (p = 0,022 e p = 0,009, rispettivamente), indipendentemente dall'ordine di parto. 

Analogamente, la fase di lattazione ha avuto un effetto significativo sulle concentrazioni di cortisolo nel pelo (Figura 3). Le tre fasi di lattazione sono risultate infatti significativamente diverse, con la seconda fase anabolica che differiva sia dalla fase catabolica (p < 0,001) che dalla prima fase anabolica (p < 0,05), queste ultime due tendevano anch'esse a differire (p = 0,051).

Le concentrazioni di cortisolo delle quattro matrici sono state analizzate in base ai livelli produttivi delle bufale e sono presentate nella Figura 4. Le mediane hanno mostrato un andamento comparabile tra le quattro matrici e l'effetto del livello produttivo è risultato significativo in tre matrici: la classe produttiva 3 differiva dalla classe 1 nel latte intero estratto (p < 0,05), dalle classi 1 (p < 0,01), 2 e 4 (p < 0,05) nel siero, dalle classi 1 e 4 nel pelo (p < 0,05).

Come riportato nella Tabella 4, la correlazione di Spearman ha mostrato che le concentrazioni di cortisolo nel pelo erano correlate negativamente con la produzione di latte maturo equivalente (EMY) e una tendenza è stata osservata con l'EFC. Analogamente, una correlazione negativa tendeva alla significatività tra le concentrazioni di cortisolo del siero e l'EFC.

Inoltre, sono state registrate correlazioni positive significative tra le concentrazioni di cortisolo del siero, cortisolo plasmatico e latte intero estratto, e tra questi ultimi due suggerendo il potenziale delle due formulazioni di latte per prevedere le concentrazioni plasmatiche di cortisolo nella bufala. Pertanto, le concentrazioni del latte sono state analizzate in un modello di regressione lineare (Figura 5).

Discussione

La valutazione obiettiva del benessere degli animali è una delle sfide che i sistemi zootecnici devono oggigiorno affrontare. La valutazione del cortisolo può rappresentare un parametro semplice, affidabile ed economico che potrebbe essere considerato in questo senso, poiché questo ormone può essere valutato in diverse matrici con significati diversi: infatti, la misurazione della concentrazione di cortisolo nel latte e nel sangue è un indicatore delle risposte allo stress acuto, mentre la sua concentrazione nei peli viene utilizzata per valutare la condizione retrospettiva degli animali.

Nella presente ricerca, abbiamo mirato a studiare sia la relazione delle concentrazioni di cortisolo con la parità, la fase della lattazione e i livelli produttivi nelle bufale di razza Mediterranea Italiana, sia a valutare le sue concentrazioni fisiologiche in diverse matrici.

Pochi studi sono riportati in letteratura sulle concentrazioni di cortisolo nelle specie bufalina. 

In questo studio, le bufale primipare e pluripare hanno mostrato concentrazioni di cortisolo simili nel latte intero estratto e nel siero. Risultati contrastanti sono presenti in letteratura. Vale comunque la pena sottolineare che è stata osservata una maggiore variabilità nella risposta allo stress delle bufale primipare rispetto alle pluripare, poiché le prime hanno evidenziato una distribuzione più asimmetrica delle concentrazioni di cortisolo nel siero di latte.

Poiché le dinamiche dei processi fisiologici associati al diverso ordine di parto sono differenti e hanno una durata temporale lunga, è probabile che finiscano per essere smorzate nel tempo e neanche il pelo, che è la matrice più retrospettiva utilizzata in questo studio, è stato in grado di evidenziare differenze tra i due gruppi.

La fase della lattazione ha influenzato ampiamente le concentrazioni di cortisolo in tutte le matrici. È noto che dopo il parto le bufale subiscono diverse modifiche fisiologiche, tra cui, il bilancio energetico negativo, l'involuzione uterina e la ripresa della ciclicità ovarica (Campanile et al. 2006, 2010).

Tutte queste condizioni rappresentano eventi stressanti per gli animali che possono rispondere con un aumento delle concentrazioni di cortisolo. Come previsto, i nostri risultati hanno mostrato un aumento della concentrazione di cortisolo negli animali nelle prime fasi della lattazione in quasi tutte le matrici considerate. 

Inoltre, la relazione tra le concentrazioni di cortisolo e i parametri produttivi è stata ulteriormente esaminata correlando i valori delle quattro matrici ai parametri del latte equivalente maturo. 

Le correlazioni negative tra il cortisolo nel pelo, la produzione di latte equivalente maturo, il contenuto in proteine equivalente maturo e il latte corretto per l'energia equivalente maturo, e tra il cortisolo nel siero e il contenuto in grasso equivalente maturo sembrano rivelare un effetto dannoso del cortisolo sui parametri di qualità e quantità del latte di bufala. 

Per perseguire l'obiettivo finale dello studio, le concentrazioni di cortisolo delle due formulazioni di latte sono state incluse in un modello di regressione, poiché hanno mostrato alti coefficienti di correlazione con il plasma. I nostri risultati suggeriscono che il siero e il latte intero estratto potrebbero essere ulteriormente investigati come potenziali predittori delle concentrazioni di cortisolo delle altre due matrici.

Se il potenziale predittivo del siero sul latte intero estratto fosse confermato, potrebbe servire a evitare il processo di estrazione necessario per misurare le concentrazioni di cortisolo nel latte intero, che è costoso, dispendioso in termini di tempo e dipendente dall'operatore. Inoltre, prevedere le concentrazioni di cortisolo plasmatico attraverso il latte potrebbe aiutare a risparmiare agli animali il prelievo di sangue, che è sempre invasivo e stressante.

Conclusioni

Si può concludere che la fase della lattazione ha mostrato un'influenza comparabile sulle concentrazioni di cortisolo nelle quattro matrici, ed è stata anche coerente con i risultati precedentemente riportati in altri ruminanti.

Al contrario, sono necessari ulteriori studi per trarre conclusioni sugli effetti dell'ordine di parto. Inoltre l'influenza del cortisolo sul livello produttivo è stata efficacemente rilevata dal pelo.

Infine, il latte sembra avere un potenziale predittivo per stimare le concentrazioni di cortisolo e potrebbe essere utilizzato come matrice per la determinazione dello stress, evitando il prelievo di sangue.

Si conclude che lo sviluppo di una misurazione automatizzata ed in tempo reale del cortisolo nel latte potrebbe essere uno strumento molto utile nell'allevamento della bufala Mediterranea Italiana.

Sinossi di: Cotticelli, A., Bifulco, G., Pividori, I., Matera, R., Verde, M. T., Santinello, M., Prandi, A., Peric, T. (2024). Assessing cortisol concentration in different matrices: predictive potential and relationship with production levels, lactation stage and parity in dairy buffaloes. Italian Journal of Animal Science,23(1), 802–812. https://doi.org/10.1080/1828051X.2024.2354502

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Dipartimento di Medicina Veterinaria e Produzioni Animali (DMVPA) – Università di Napoli Federico II