Residui di antibiotici nel latte crudo lombardo: integrazione di test microbiologici e LC-HRMS

Introduzione

Gli antibiotici sono ampiamente utilizzati negli animali da produzione alimentare sia a scopo preventivo sia terapeutico, ma il loro uso può portare alla contaminazione di alimenti di origine animale, come carne, uova e latte, con residui potenzialmente dannosi per la salute umana. Tali residui possono innescare reazioni allergiche, alterare il microbiota intestinale e contribuire alla diffusione della resistenza agli antibiotici.

I bovini da latte sono frequentemente esposti alla mastite, un’infezione batterica che incide sulla salute animale e sulla qualità della produzione di latte, e vengono trattati con farmaci delle famiglie dei β-lattamici, macrolidi, chinolonici e sulfamidici. Quando i periodi di sospensione non vengono rispettati o i trattamenti sono inappropriati, residui di principi attivi e dei loro metaboliti possono accumularsi nel latte, rappresentando un rischio per i consumatori.

Nell’Unione Europea la contaminazione alimentare da farmaci veterinari è strettamente regolata dal Regolamento UE 37/2010, che stabilisce i limiti massimi di residui (LMR). In Italia, e in particolare in Lombardia, dove si produce circa il 40% del latte crudo nazionale, il latte destinato alla trasformazione lattiero-casearia viene regolarmente sottoposto a screening nell’ambito del sistema di pagamento della qualità del latte.

I test microbiologici basati sull’inibizione della crescita, come Delvotest® SP NT, sono largamente impiegati per il rilevamento di residui di β-lattamici, mentre metodi chimici più sofisticati basati su LC-HRMS consentono l’identificazione semi-quantitativa di diverse famiglie di antibiotici con maggiore sensibilità e specificità.

In questo studio pubblicato su Heliyon nel 2023,  sono stati analizzati i dati raccolti tra gennaio 2018 e giugno 2022 dal Centro di Referenza Nazionale per la Qualità del Latte Bovino (IZSLER). L’obiettivo era valutare la qualità del latte crudo prima della trasformazione, stimare l’incidenza della contaminazione antibiotica e identificare gli agenti antimicrobici presenti. L’integrazione di screening microbiologico e conferma tramite LC-HRMS (Liquid Chromatography – High Resolution Mass Spectrometry) si è rivelata un approccio efficace per un monitoraggio accurato dei residui di antibiotici, garantendo sicurezza alimentare e qualità tecnologica nella filiera lattiero-casearia.

Materiali e metodi

Raccolta del campione

Tra il 2018 e il 2022 sono stati raccolti 408.033 campioni di latte bovino da allevamenti lombardi, rappresentativi dell’intera mandria. Il campione era prelevato dai serbatoi di stoccaggio e conservato a 0–4 °C fino all’analisi entro 48 ore. I campioni positivi al test microbiologico sono stati conservati a -20 °C per ulteriori analisi con LC-HRMS.

Screening NT Delvotest® SP

Reagenti, standard e terreno di coltura

Il kit Delvotest® SP NT (DSM Food Specialties) è stato utilizzato per la determinazione dei residui di antibiotici. Latte privo di sostanze inibitorie è stato preparato da latte UHT, testato per l’assenza di antibiotici e liofilizzato. Gli standard di penicillina e sulfadiazina sono stati preparati aggiungendo i composti al latte UHT parzialmente scremato e liofilizzando le fiale, poi conservate a 6 ± 4 °C per fino a 10 anni. Il terreno di coltura fornito nel kit conteneva agar gelificato, nutrienti, spore di Bacillus stearothermophilus var. calidolactis e porpora di bromocresolo come indicatore di pH.

Analisi NT Delvotest® SP

I campioni sono stati miscelati e inoculati automaticamente nei pozzetti (100 μl) tramite sistema SKALAR SP2000. Controlli negativi (latte privo di sostanze inibitorie) e controlli positivi (standard di penicillina e sulfadiazina) sono stati inclusi. La piastra è stata incubata a 64 ± 1 °C per circa 2:45 ore. La colorazione gialla indicava risultato negativo, viola/blu indicava positivo, mentre colorazioni parziali erano considerate incerte.

Screening qualitativo LC-HRMS

Prodotti chimici e reagenti

Gli standard di riferimento e interni deuterati sono stati utilizzati per l’analisi. I solventi HPLC (acetonitrile, metanolo, acido formico) sono stati acquistati da Carlo Erba Reagents, mentre EDTA e acetato di ammonio da Merck KGaA.

Preparazione degli standard

Tutte le molecole di riferimento sono state preparate a 100 μg/ml, eccetto i sulfonamidi a 500 μg/ml. Le soluzioni madre di amfenicoli, macrolidi, sulfonamidi, tetracicline, trimetoprim, lincomicina e rifaximina sono state preparate in metanolo HPLC, mentre i chinoloni in metanolo/acqua (80:20 v/v). I β-lattamici sono stati preparati in acqua/acetonitrile (75:25 v/v). Gli standard interni deuterati sono stati preparati a 100 μg/ml in metanolo o acqua/acetonitrile secondo il composto. Le soluzioni madre sono state conservate a -24 ± 6 °C, tranne sulfonamidi e trimetoprim a 5 ± 3 °C. La stabilità variava tra 12 e 48 mesi, eccetto la 4-epiossitetraciclina (1 mese). Pool di analiti standard sono stati preparati per campioni fortificati e conservati a -24 ± 6 °C fino a un mese.

Preparazione del campione

I campioni positivi o incerti al Delvotest® SP NT sono stati scongelati e pesati in provette da 15 ml. Sono stati aggiunti standard interni per una concentrazione finale di 0,05 μg/ml. Controlli in bianco e positivi (fortificati alla CCβ: 2–10 μg/kg) sono stati preparati allo stesso modo. L’estrazione prevedeva centrifugazioni multiple, aggiunta di EDTA e acetonitrile, agitazione, ultrasuoni e evaporazione sotto azoto. I campioni secchi sono stati raccolti in acetato di ammonio 0,2 M, centrifugati e trasferiti in fiale per LC-HRMS.

Analisi LC-HRMS

10 μl di campione sono stati iniettati nel sistema LC-HRMS Thermo Fischer Accela HPLC collegato a LTQ Orbitrap. La separazione è avvenuta su colonna Poroshell 120 EC-C18 protetta da precolonna, con fasi mobili metanolo HPLC e soluzione acquosa di acido formico 0,1%, gradiente binario e flusso 0,25 ml/min. La ionizzazione è stata effettuata in polarità positiva mediante HESI. La linearità è stata testata a 1, 5 e 10 μg/kg. Il metodo è stato validato secondo la Decisione Europea 657/2002 (ora regolamento UE 808/2021). La specificità e capacità di rilevamento (CCβ) sono state confermate analizzando 20 ripetizioni di campioni bianchi e fortificati, senza interferenze rilevabili.

Risultati e discussione

Sensibilità e convalida del Delvotest® SP NT

Il kit commerciale Delvotest® SP NT è convalidato per quattro antibiotici β-lattamici. Secondo il produttore, la sensibilità (concentrazione per cui il 95% dei campioni risulta positivo) è di 2,5 μg/kg per amoxicillina, 3,0 μg/kg per ampicillina, 1,5 μg/kg per penicillina G e 5,8 μg/kg per cefapirina.

Lo studio ha inoltre valutato la sensibilità del test su 17 composti antibiotici di diverse famiglie. Il Delvotest® SP NT si è mostrato altamente reattivo verso i β-lattamici, mentre macrolidi e altri composti hanno mostrato bassi profili di rilevamento a concentrazioni superiori ai limiti massimi di residuo (LMR).

Il kit è stato sottoposto a test di competenza interlaboratorio, con 4 risultati non conformi (3,1%) su 131 campioni analizzati. Studi di altri autori, come Le Breton et al. [20], hanno confermato la capacità del test di rilevare penicillina, cloxacillina, sulfametazina, sulfadiazina, cefalexina e gentamicina a livelli pari o inferiori ai LMR.

In sintesi, Delvotest® SP NT si conferma uno strumento affidabile per lo screening rapido dei residui di β-lattamici nel latte, pur con limitazioni nella rilevazione di altre famiglie di antibiotici.

Nel quadriennio 2018-2022 sono stati analizzati 408.033 campioni di latte bovino. Lo screening con Delvotest® SP NT ha rilevato 364 campioni positivi, corrispondenti a un tasso di positività dello 0,08%. Il tasso annuo variava dallo 0,1% allo 0,07%, mostrando un andamento stabile e in lieve diminuzione (Tabella 1).

Tabella 1. Numero di risultati positivi e negativi allo screening Delvotest® SP NT su campioni di latte durante l’analisi di routine. Le percentuali sono indicate tra parentesi.

Questi dati sono in linea con i report annuali dell’EFSA, che riportano rispettivamente lo 0,04%, lo 0,12% e lo 0,07% di campioni non conformi per sostanze antibatteriche nel 2018, 2019 e 2020, secondo la Direttiva 96/23/CE [29–31]. Ciò indica che la qualità del latte conferito in Lombardia mantiene standard elevati, presumibilmente grazie alla legislazione UE sui farmaci veterinari, ai controlli territoriali e agli alti standard richiesti per la produzione lattiero-casearia.

Studi comparativi mostrano situazioni simili in Croazia, con un’incidenza dello 0,69% di campioni positivi tra il 2008 e il 2010. Al contrario, percentuali più elevate sono state osservate in Kosovo (6,11%) [33] e Romania (4,45%) [34], dove i programmi di monitoraggio erano assenti o meno rigorosi. Tuttavia, negli ultimi dieci anni i dati sulla presenza di residui di antibiotici nei paesi europei sono limitati, mentre i report disponibili provengono prevalentemente da contesti extraeuropei, mostrando scenari molto variabili.

In sintesi, lo screening Delvotest® SP NT conferma la bassa incidenza di residui antibiotici nel latte lombardo e sottolinea l’efficacia dei programmi di controllo e della legislazione vigente.

Limitazioni del Delvotest® SP NT

Sebbene il Delvotest® SP NT sia uno strumento di screening affidabile e validato, possono verificarsi risultati falsi positivi o incerti, caratterizzati da colorazioni irregolari o poco chiare. I falsi positivi sono spesso correlati a elevate cellule somatiche dovute a mastite e a livelli aumentati di lisozima e lattoferrina.

Alcuni studi hanno evidenziato preoccupazioni riguardo ai falsi negativi. Chiesa et al. hanno riportato il 68% di falsi negativi nel latte di bovine precedentemente trattate con antibiotici usando LC-HRMS, mentre studi di validazione su molecole specifiche (nafcillina, ossitetraciclina, tetraciclina, rifaximina) con la versione migliorata Delvotest® T hanno mostrato solo 1,7–4,9% di falsi negativi. Inoltre, il Delvotest® SP NT non identifica il tipo specifico di antibiotico, per cui è necessario un metodo analitico di conferma.

Conferma tramite LC-HRMS

Non tutti i campioni positivi erano disponibili per l’analisi LC-HRMS. Nel presente studio, 79 campioni positivi e 21 incerti sono stati sottoposti a screening LC-HRMS multiclasse per 62 composti. Il metodo, semiquantitativo, permette identificazione precisa degli ioni di massa e stima delle concentrazioni.

Dei campioni testati, 48/79 (60,8%) positivi e 6/21 (28,6%) incerti contenevano almeno un residuo di β-lattamici (Tabella 2). Due campioni contenevano residui multipli, con concentrazioni inferiori agli LMR per ogni singolo antibiotico, ma con possibile rischio combinato. Ulteriori 20 campioni presentavano tracce non quantificabili.

Nel gruppo confermato, 28 residui superavano gli LMR, con due campioni cinque volte sopra i limiti: 324 μg/kg per rifaximina e 28 μg/kg per ampicillina. Nei campioni incerti, due presentavano penicillina G intorno a 5 μg/kg, vicino all’LMR (4 μg/kg), senza superamenti significativi.

Tabella 2 . Residui di antibiotici identificati mediante analisi di screening LC-HRMS sui risultati positivi e incerti del Delvotest ® SP NT.

Antibiotici rilevati nei campioni positivi

Il composto più diffuso tra i campioni positivi allo screening è stata la penicillina G, rilevata in 22 campioni. I β-lattamici rappresentavano la maggior parte dei casi, con un totale di 45 campioni positivi. Questo riflette sia l’ampio utilizzo di penicilline e cefalosporine di prima e seconda generazione per il trattamento della mastite bovina tramite infusione intramammaria, sia la specificità e sensibilità di Delvotest® SP NT per questa famiglia di composti. I risultati sono coerenti con studi precedenti: Rama et al. hanno rilevato β-lattamici in 32 su 55 campioni positivi, e Ghidini et al. hanno confermato 31 su 53 campioni positivi mediante LC-MS/MS.

Il composto più abbondante non β-lattamico è stata la rifaximina (6 campioni positivi), un antibiotico della famiglia delle ansamicine. Uno studio di Serraino et al.  ha confermato che la rifaximina è l’antibiotico non β-lattamico più utilizzato negli allevamenti da latte del Nord Italia. Grazie alla sua scarsa assorbibilità orale (<1%), la rifaximina viene impiegata per infezioni locali dell’apparato riproduttivo e della mastite nel periodo di asciutta. Studi precedenti indicano che i residui di rifaximina non sono rilevabili nel latte dopo 6 ore dal trattamento.

La rilevazione di bassi livelli di rifaximina (11–17 μg/kg) nei campioni positivi allo screening potrebbe essere dovuta alla associazione commerciale con cefacetrile, una cefalosporina di prima generazione non analizzata dal metodo LC-HRMS, e quindi non confermata. La sensibilità di Delvotest® SP NT alla rifaximina non è ben definita, ma studi precedenti indicano il rilevamento a 60 μg/kg, valore pari al MRL.

Conclusioni

Il presente studio evidenzia che il tasso di contaminazione del latte bovino lombardo nel quadriennio 2018-2022 è stato dello 0,08%, come rilevato mediante Delvotest® SP NT. L’analisi mediante spettrometria di massa su campioni positivi ha confermato che il 60,8% conteneva uno o più residui di antibiotici, con predominanza dei β-lattamici e della penicillina G come composto più abbondante.

Questi dati suggeriscono che bassi livelli di contaminazione sono stati costantemente mantenuti negli ultimi quattro anni. L’integrazione di screening microbiologico e spettrometria di massa rappresenta uno strumento efficace per un monitoraggio accurato e approfondito dei residui di antibiotici nel latte.

Il sistema di pagamento della qualità del latte consente l’analisi quotidiana di circa 400 campioni provenienti da allevamenti regionali, generando un ampio database di sorveglianza. Tuttavia, la conferma mediante spettrometria di massa è cruciale per identificare il composto specifico e determinarne la concentrazione, poiché eventuali superamenti dei LMR devono essere segnalati alle autorità competenti.

Sebbene la spettrometria di massa sia troppo costosa e laboriosa per lo screening di massa, la sua applicazione combinata con test microbiologici consente un monitoraggio su larga scala efficiente e affidabile, contribuendo anche ai programmi europei per il controllo della resistenza antimicrobica negli alimenti di origine animale.

Fonte: “Screening of antibiotic residues in raw bovine milk in Lombardy, Italy: Microbial growth inhibition assay and LC-HRMS technique integration for an accurate monitoring”, Elena Butovskaya,Lorenzo Gambi, Alice Giovanetti, Giorgio Fedrizzi. Heliyon, Volume 9, Issue 4, April 2023, e15395. http://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e15395.