Il lievito che si è adattato al latte: il caso dei ceppi Yaghnob

Introduzione

La conoscenza dell’ecologia e dell’evoluzione di Saccharomyces cerevisiae si è ampliata grazie al sequenziamento genomico e all’identificazione di ceppi provenienti da nicchie diverse. Sebbene noto soprattutto per la fermentazione alcolica, il lievito è stato isolato anche da prodotti lattiero-caseari, dove potrebbe aver sviluppato specifici adattamenti evolutivi. L’ambiente caseario è dominato dai batteri lattici e dal lattosio, che S. cerevisiae non può metabolizzare direttamente. Alcuni ceppi lattiero-caseari presentano infatti molteplici copie di geni coinvolti nel metabolismo del galattosio, ma questo potrebbe non essere sufficiente a spiegare il loro adattamento.

Lo studio si concentra sui ceppi di S. cerevisiae isolati dal latte di capra fermentato tradizionalmente dagli Yaghnobi, popolazione etnolinguisticamente distinta che vive nelle remote montagne del Tagikistan. La loro lunga storia di isolamento e la tradizionale produzione di latte fermentato e formaggio offrono un ambiente poco influenzato dall’industrializzazione moderna.

L’area abitata dagli Yaghnobi si trova inoltre lungo una possibile rotta di migrazione e domesticazione di S. cerevisiae dall’Asia orientale verso altre regioni. I ceppi Yaghnob rappresentano quindi un’opportunità unica per studiare antichi processi di selezione, adattamento e domesticazione del lievito negli ambienti lattiero-caseari.

Materiali e metodi

Sono stati studiati sei ceppi di Saccharomyces cerevisiae isolati da fermentazioni tradizionali di latte di capra degli Yaghnobi, confrontandoli con 1.053 genomi provenienti da diverse origini.

I genomi sono stati sequenziati con tecnologie PacBio e Illumina, assemblati e analizzati per identificare differenze genetiche, SNP, varianti strutturali e caratteristiche filogenetiche. Sono state inoltre studiate le strutture e le funzioni delle proteine coinvolte nel metabolismo del galattosio.

Per valutare l’adattamento all’ambiente caseario, sono state confrontate le curve di crescita in glucosio e galattosio e analizzata l’espressione genica mediante RNA-seq, identificando i geni e i percorsi metabolici maggiormente coinvolti nella risposta al galattosio.

Risultati

Sequenziamento genomico e diversità filogenetica

I 10 ceppi di S. cerevisiae Yaghnob hanno mostrato una capacità di crescita significativamente superiore in presenza di galattosio, arabinosio e mannosio rispetto ad altri lieviti isolati dalla stessa fonte e a ceppi provenienti da altri ambienti.

Sei ceppi, selezionati per rappresentare la diversità genetica osservata, sono stati sequenziati con PacBio. Il confronto genomico ha evidenziato una sostanziale collinearità con il ceppo di riferimento S288C. I ceppi Yaghnob presentavano numerose varianti genetiche e, come gli altri ceppi lattiero-caseari, un numero elevato di varianti strutturali, soprattutto duplicazioni, inserzioni e contrazioni, suggerendo un possibile ruolo di queste modificazioni nell’adattamento all’ambiente caseario.

L’analisi filogenetica ha collocato i ceppi Yaghnob alla base del cluster Dairy, insieme a ceppi provenienti prevalentemente da latte e formaggi, confermando una particolare relazione evolutiva con l’ambiente lattiero-caseario.

Figura 1 – Albero filogenetico dei ceppi di S. cerevisiae di Yaghnob . (A) Albero neighbor-joining costruito sulle sequenze di proteine ​​predette condivise. I cladi sono stati identificati in base all’analisi della struttura dell’ascendenza. (B) Ingrandimento del clade Dairy con i nomi dei ceppi e le origini identificabili tramite la legenda. (C) Risultati dell’ascendenza per i ceppi Dairy secondo l’analisi della struttura.

La Figura 1 mostra l’albero filogenetico dei ceppi di S. cerevisiae e l’analisi della loro ascendenza, evidenziando la posizione dei ceppi Yaghnob all’interno del cluster Dairy.

Caratteristiche genomiche dei ceppi Yaghnob

Il confronto genomico ha evidenziato geni assenti nei ceppi lattiero-caseari ma presenti in altri ceppi e, viceversa, geni specifici o fortemente arricchiti nei ceppi Yaghnob. Particolarmente interessante è la presenza di differenze nei geni GAL2, GAL1, GAL10 e GAL7, fondamentali per il metabolismo del galattosio.

I ceppi Yaghnob possiedono inoltre 39 CDS potenzialmente specifici, alcuni condivisi con altri ceppi lattiero-caseari e altri esclusivi degli Yaghnob. Sono state identificate anche numerose varianti aminoacidiche e SNP specifici, alcuni associati a funzioni metaboliche, alla regolazione del ciclo cellulare e all’organizzazione degli organelli.

Figura 2 – Confronto delle caratteristiche genomiche e genetiche dei ceppi da latte e Yaghnob. (A) Diagramma di Venn che mostra la distribuzione dei CDS identificati nel set di dati genomici. (B) Diagramma di Venn che mostra il numero di varianti aminoacidiche trovate nelle 347 sequenze CDS condivise tra tutti i ceppi in esame. (C) Diagramma di Venn che mostra il numero di SNP trovati nei ceppi da latte o Yaghnob; il sottoinsieme “identico” del compartimento da latte indica SNP identici trovati nello stesso locus del genoma di riferimento; il sottoinsieme “diverso nei ceppi da latte” riporta SNP diversi tra i ceppi da latte e Yaghnob ma presenti nello stesso locus del genoma di riferimento. (A – C) I numeri nelle ellissi bianche con perimetro rosso o blu rappresentano le caratteristiche assenti rispettivamente nei ceppi Yaghnob o da latte. I numeri nelle ellissi colorate con perimetro rosso o blu mostrano i CDS presenti solo nei ceppi Yaghnob o latticini, rispettivamente. + = specifico, caratteristica presente in tutti i componenti del gruppo riportato e in meno del 10% degli altri ceppi del dataset; ++ = altamente specifico, caratteristica presente solo nel gruppo indicato. (D) Mappe di calore che riportano le informazioni relative ai CDS e agli SNP specifici per i sei ceppi Yaghnob. Le prime tre righe della mappa di calore si riferiscono al numero totale di SNP specifici del ceppo, ai CDS interessati da questi SNP e al numero di CDS specifici del ceppo come indicato nel testo a destra. La quarta riga mostra il numero di CDS che non è stato possibile annotare secondo il riferimento S288C. L’ultima parte della mappa di calore riporta i CDS annotati specifici per ceppo (al centro) o i CDS con SNP (a destra) specifici per i ceppi Yaghnob, suddivisi in non annotati, annotati e con informazioni sulla presenza del CDS in altri ceppi. I geni annotati sono riportati una sola volta, anche quando presenti in più gruppi ortologhi, per evitare ridondanze. A sinistra , il colore della cella indica il numero di ceppi nel database che presentano il CDS indicato (con una diversa percentuale di allineamento rispetto al riferimento, come indicato nella legenda); i numeri indicano le diverse varianti di sequenza osservate per il CDS nei ceppi non Yaghnob. I geni in grassetto codificano per proteine ​​di fusione gag-pol.

La Figura 2 riassume il confronto dei CDS, delle varianti aminoacidiche e degli SNP tra ceppi Yaghnob, lattiero-caseari e altri ceppi di S. cerevisiae.

Adattamento al metabolismo del galattosio

Nonostante i ceppi Yaghnob sembrino privi dei geni classici GAL2, GAL1, GAL10 e GAL7, essi sono in grado di utilizzare efficacemente il galattosio. L’analisi genomica ha infatti evidenziato varianti alternative di questi geni, con caratteristiche strutturali compatibili con le rispettive funzioni enzimatiche.

In particolare, le proteine coinvolte nella via di Leloir mostrano caratteristiche che potrebbero consentire agli Yaghnob di mantenere un metabolismo efficiente del galattosio attraverso una via evolutivamente modificata. Alcuni geni GAL risultano inoltre più simili a quelli presenti in altre specie di Saccharomyces, suggerendo la possibile conservazione di caratteristiche ancestrali della via metabolica.

Figura 3 – Confronto delle caratteristiche genomiche e genetiche dei ceppi da latte e Yaghnob. (A) Diagramma di Venn che mostra la distribuzione dei CDS identificati nel set di dati genomici. (B) Diagramma di Venn che mostra il numero di varianti aminoacidiche trovate nelle 347 sequenze CDS condivise tra tutti i ceppi in esame. (C) Diagramma di Venn che mostra il numero di SNP trovati nei ceppi da latte o Yaghnob; il sottoinsieme “identico” del compartimento da latte indica SNP identici trovati nello stesso locus del genoma di riferimento; il sottoinsieme “diverso nei ceppi da latte” riporta SNP diversi tra i ceppi da latte e Yaghnob ma presenti nello stesso locus del genoma di riferimento. (A – C) I numeri nelle ellissi bianche con perimetro rosso o blu rappresentano le caratteristiche assenti rispettivamente nei ceppi Yaghnob o da latte. I numeri nelle ellissi colorate con perimetro rosso o blu mostrano i CDS presenti solo nei ceppi Yaghnob o latticini, rispettivamente. + = specifico, caratteristica presente in tutti i componenti del gruppo riportato e in meno del 10% degli altri ceppi del dataset; ++ = altamente specifico, caratteristica presente solo nel gruppo indicato. (D) Mappe di calore che riportano le informazioni relative ai CDS e agli SNP specifici per i sei ceppi Yaghnob. Le prime tre righe della mappa di calore si riferiscono al numero totale di SNP specifici del ceppo, ai CDS interessati da questi SNP e al numero di CDS specifici del ceppo come indicato nel testo a destra . La quarta riga mostra il numero di CDS che non è stato possibile annotare secondo il riferimento S288C. L’ultima parte della mappa di calore riporta i CDS annotati specifici per ceppo (al centro) o i CDS con SNP (a destra) specifici per i ceppi Yaghnob, suddivisi in non annotati, annotati e con informazioni sulla presenza del CDS in altri ceppi. I geni annotati sono riportati una sola volta, anche quando presenti in più gruppi ortologhi, per evitare ridondanze. A sinistra , il colore della cella indica il numero di ceppi nel database che presentano il CDS indicato (con una diversa percentuale di allineamento rispetto al riferimento, come indicato nella legenda); i numeri indicano le diverse varianti di sequenza osservate per il CDS nei ceppi non Yaghnob. I geni in grassetto codificano per proteine ​​di fusione gag-pol.

La Figura 3 illustra i geni e le strutture proteiche coinvolte nella via di Leloir, mostrando le differenze tra Yaghnob e il ceppo di riferimento S288C.

Prestazioni di crescita e risposta trascrizionale

Gli esperimenti hanno confermato che i ceppi Yaghnob presentano una migliore capacità di crescita in galattosio rispetto ai ceppi provenienti da altre fonti. La fase di latenza è risultata significativamente più breve sia in glucosio sia, soprattutto, in galattosio, mentre il tempo di raddoppio in galattosio è risultato quasi dimezzato.

L’analisi RNA-seq ha inoltre mostrato che gli Yaghnob attivano più rapidamente il metabolismo del galattosio: tutti i principali geni della via di Leloir risultano sovraespressi. Questi risultati indicano un adattamento particolarmente efficace a un ambiente caseario competitivo, dove il galattosio rappresenta una risorsa importante.

Figura 4 – Confronto della capacità di crescita in galattosio degli isolati di Yaghnob con ceppi di S. cerevisiae provenienti da altre fonti. (A) Tempi di latenza e di raddoppio (in ore) misurati per Yaghnob e altri ceppi in terreno minimo supplementato con galattosio o glucosio. * = Wilcoxon–Mann–Whitney fdr < 0,05. (B) Mappa di calore che mostra i percorsi KEGG e Reactome sovrarappresentati nell’elenco dei geni differenzialmente espressi trovati tramite RNAseq degli isolati di Yaghnob e di altri ceppi. (C) Rappresentazione schematica del livello di espressione (rapporto tra le letture espresse in presenza di galattosio e le letture espresse in presenza di glucosio) dei geni associati al metabolismo del galattosio. Per ciascun ceppo, il rapporto è indicato nel quadrato corrispondente, come mostrato in figura.

La Figura 4 confronta tempi di latenza e raddoppio, espressione genica e attivazione della via metabolica del galattosio nei ceppi Yaghnob e negli altri ceppi di S. cerevisiae.

Discussione

Il particolare isolamento geografico e culturale degli Yaghnobi rende improbabile una contaminazione recente dei ceppi di S. cerevisiae da popolazioni provenienti da altre aree. La loro struttura genomica a mosaico potrebbe quindi rappresentare una caratteristica ancestrale, conservata nella valle di Yaghnob dopo le antiche migrazioni.

Il raggruppamento con altri ceppi lattiero-caseari suggerisce un percorso evolutivo comune legato all’utilizzo del galattosio. I ceppi Yaghnob presentano inoltre geni specifici e un percorso alternativo di Leloir, che indicano un adattamento particolarmente efficace all’ambiente lattiero-caseario.

Questo adattamento li rende più efficienti e competitivi nell’utilizzo del galattosio, favorendone la crescita in un ambiente ricco di microrganismi fermentativi. Le principali modificazioni evolutive interessano soprattutto le regioni subtelomeriche e sembrano essere state guidate dalla disponibilità delle diverse fonti di carbonio.

Fonte: “Genomic signatures of dairy adaptation in Saccharomyces cerevisiae from traditional Yaghnob goat-cheese fermentation”, Marina Bambia, Ahmed El Goutbib, Monica Di Paolab, Matilda Bellinib , Benedetta Cerasuolob et al.

Autore: Elisabetta Simonetti