Cambiamenti del microbiota durante il processo di caseificazione: dal latte crudo al formaggio finito

Introduzione

La ricerca sugli NSLAB (batteri lattici non starter) è sempre più importante per comprendere lo sviluppo del microbiota dei formaggi durante la stagionatura. Questi microrganismi, spesso appartenenti al genere Lactobacillus e in particolare a L. paracasei, possono essere presenti nel latte crudo e moltiplicarsi progressivamente nel formaggio, contribuendo allo sviluppo del suo aroma caratteristico. La loro origine è ancora discussa, ma il latte crudo rappresenta una delle principali possibili fonti. La loro presenza è influenzata da diversi fattori aziendali, tra cui il sistema di mungitura, il pretrattamento dei capezzoli e le condizioni igieniche.

Il miglioramento dell’igiene ha ridotto la carica batterica del latte crudo, limitando potenzialmente la capacità degli NSLAB di diventare dominanti durante la stagionatura. Lo studio pubblicato su International Dairy Journal a settembre 2025,  ha quindi valutato se il tipo di insilato somministrato alle vacche, mantenendo costanti gli altri fattori, potesse modificare il microbiota del latte e dei formaggi stagionati fino a 22 mesi. Latte e formaggi sono stati analizzati mediante sequenziamento del gene 16S rRNA, per verificare l’eventuale influenza dell’alimentazione sulla presenza degli NSLAB e sullo sviluppo del microbiota responsabile delle caratteristiche aromatiche del formaggio.

Materiali e metodi

Il latte utilizzato proveniva da un precedente esperimento di alimentazione con diversi tipi di insilato, prodotti con o senza additivi conservanti. Gli insilati sono stati prodotti nel 2020 e somministrati alle vacche tra gennaio e aprile 2021, con periodi sperimentali di tre settimane. Il formaggio è stato prodotto nello stesso periodo presso un caseificio di Burträsk e sottoposto a stagionatura fino a 22 mesi, fino a febbraio 2023. Si trattava di un formaggio regionale a pasta dura, a lunga stagionatura e salato in salamoia.

Latte crudo

L’esperimento ha coinvolto circa 67 vacche di razza Rossa Svedese, allevate presso la SLU di Umeå. Gli animali hanno ricevuto quattro tipi di insilato: non trattato (T1-UNTR), inoculato con colture starter (T2-INOC e T4-INOC) o trattato con acido (T3-ACID). Ogni dieta è stata somministrata per tre settimane e il trattamento con insilato inoculato è stato ripetuto per verificarne la riproducibilità. Il latte di massa è stato raccolto tre volte nell’ultima settimana di ciascun periodo. Complessivamente sono stati raccolti circa 3500 litri di latte per ciascun campionamento e trasportati al caseificio entro due ore.

Produzione del formaggio

Il latte è stato preriscaldato, standardizzato a circa 3,65 g di grasso/100 g, pastorizzato a 72 °C per 15 secondi e raffreddato a 30 °C. È stata quindi aggiunta una coltura starter mesofila contenente principalmente Lactococcus lactis e Leuconostoc. Dopo la pre-maturazione sono stati aggiunti caglio, CaCl₂ e NaNO₃. La cagliata è stata sottoposta a una lunga cottura, a temperature superiori a 40 °C, quindi trasferita negli stampi e pressata. Da ogni lotto sono state ottenute quattro forme da circa 18 kg. I formaggi sono stati salati in salamoia e stagionati a 10-13 °C.

Campionamento

Sono stati raccolti campioni di latte crudo, latte fermentato, cagliata e formaggio. Il latte crudo è stato prelevato prima della pastorizzazione, mentre latte fermentato e cagliata sono stati campionati durante la caseificazione. I formaggi freschi sono stati campionati 24 ore dopo la pressatura e successivamente a intervalli prestabiliti durante i 22 mesi di stagionatura. Per evitare contaminazioni e alterazioni del processo, ogni forma è stata campionata soltanto due volte, praticando prelievi profondi circa 10 cm e scartando la parte esterna.

Preparazione e analisi del campione

Le analisi della composizione chimica e della carica batterica sono state eseguite subito dopo il campionamento, mentre i campioni destinati allo studio del microbiota sono stati congelati a -80 °C e trasferiti alla SLU di Uppsala. La composizione del latte e del formaggio è stata determinata rispettivamente con MilkoScan e FoodScan, mentre il pH è stato misurato con un pHmetro.

Campioni di latte

Nel latte crudo sono state determinate le principali popolazioni batteriche coltivabili attraverso semina su specifici terreni di coltura. Sono state valutate la carica batterica aerobica totale, i batteri termoresistenti, i psicrotrofi e le Enterobacteriaceae, utilizzando differenti condizioni di temperatura e incubazione.

Campioni di formaggio

Nei formaggi sono state determinate la carica batterica aerobica totale, i lattobacilli, i batteri lattici fermentanti il citrato, lieviti e muffe. Le colonie sono state inoltre suddivise in gruppi sulla base delle caratteristiche di crescita, distinguendo batteri acidogeni, Lactococcus lactis biovar. diacetylactis e Leuconostoc. Le proprietà sensoriali sono state valutate a 12, 14, 18, 20 e 22 mesi da 2-3 assaggiatori esperti, utilizzando una scala standardizzata a nove livelli.

Analisi del microbiota

I campioni congelati sono stati scongelati e sottoposti all’estrazione del DNA batterico. Per i campioni di formaggio sono stati utilizzati 25 g di materiale, omogeneizzati con soluzione salina tamponata. Il DNA estratto è stato conservato a -80 °C prima dell’amplificazione e del sequenziamento. Nei campioni di formaggio a 22 mesi è stato inoltre utilizzato monoazide di propidio (PMA) per eliminare il DNA derivante da batteri morti e ottenere una rappresentazione più vicina alla comunità batterica vitale.

Costruzione e sequenziamento della libreria

È stata amplificata la regione V4 del gene 16S rRNA, utilizzando specifici primer. Le librerie sono state quindi sottoposte a controllo di qualità e sequenziate con piattaforma Illumina NovaSeq PE250, ottenendo circa 50.000 letture per campione. I dati grezzi sono stati depositati nel database Sequence Read Archive del NCBI.

Valutazione statistica

I dati sono stati analizzati in R utilizzando diversi pacchetti statistici e microbiologici. La diversità alfa è stata confrontata con il test di Kruskal-Wallis, mentre la beta-diversità è stata valutata mediante PERMANOVA. I valori di p sono stati corretti con il metodo di Benjamini-Hochberg e p ≤ 0,05 è stato considerato significativo. La composizione batterica è stata analizzata dopo rarefazione a 32.033 letture per campione. I taxa con abbondanza relativa inferiore allo 0,1% sono stati considerati rilevati ma non come risultati certi. Gli effetti dei trattamenti sui singoli generi o ASV sono stati valutati mediante regressioni quasi-Poisson e confronti a coppie con correzione di Tukey.

Risultati

Microbiota nei diversi materiali

Il latte crudo ha mostrato la maggiore alfa-diversità (FPDI 24,2), seguito dai formaggi in stagionatura (18,6), dai campioni della caseificazione (17,5) e dalla coltura starter (8,7). La PCoA ha evidenziato una netta differenza tra il microbiota del latte crudo e quello degli altri materiali, mentre coltura starter, caseificazione e formaggio stagionato presentavano una parziale sovrapposizione. Lactococcus è risultato il genere dominante nei diversi passaggi della trasformazione, seguito da Leuconostoc e Lactobacillus. Nel latte crudo, invece, il microbiota era molto più diversificato: i 20 generi principali rappresentavano circa il 75% dell’abbondanza relativa (figura 1).

Figura 1 – Media dei 20 generi più abbondanti in tutti i punti di campionamento lungo la catena del valore, dal latte crudo al formaggio stagionato, comprese le colture starter.

Composizione chimica, conta batterica e microbiota nel latte crudo

La variabilità della composizione e della carica batterica del latte era maggiore tra i diversi lotti che tra i trattamenti di insilamento. I trattamenti T2-INOC e T4-INOC hanno mostrato in alcuni lotti le conte batteriche totali più elevate e una maggiore presenza di Enterobacteriaceae; T4-INOC (B2) ha inoltre presentato una concentrazione particolarmente elevata di batteri psicrotrofi. La composizione chimica è risultata sostanzialmente simile, con una tendenza a una maggiore sostanza secca in T4-INOC.

Tabella 1- Carica batterica, composizione chimica e pH del latte crudo per trattamento e lotto

La diversità alfa era leggermente inferiore nei trattamenti T2-INOC e T3-ACID, ma solo T2-INOC differiva significativamente da T1-UNTR e T4-INOC. La PERMANOVA non ha invece evidenziato differenze significative nella composizione del microbiota tra i trattamenti. Anche in questo caso, la variabilità tra lotti era maggiore di quella associata all’insilato. Nei lotti T2-INOC (B1) e T4-INOC (B2) sono state osservate elevate abbondanze relative di Acinetobacter e Pseudomonas, mentre T4-INOC (B2) presentava anche un’elevata presenza di Staphylococcus.

Figura 2 – Principali generi batterici presenti nel latte crudo per trattamento e lotto

Enumerazione batterica e composizione chimica dei grani di formaggio e del formaggio fresco

Nei grani e nel formaggio fresco le variazioni della composizione chimica e della carica batterica sono state generalmente contenute, mentre le Enterobacteriaceae hanno mostrato una forte variabilità tra i lotti. L’aggiunta della coltura starter ha determinato un marcato cambiamento della popolazione microbica: la carica batterica totale è passata da 3,0-4,2 log₁₀ UFC/mL nel latte crudo a 6,1-6,6 log₁₀ UFC/g nella cagliata e 5,8-7,5 log₁₀ UFC/g nel formaggio fresco. I batteri acidogeni raggiungevano 6,5-6,8 log₁₀ UFC/g, mentre Leuconostoc era al di sotto del limite di rilevabilità.

Tabella 2 – Conteggio batterico (log 10 CFU/g), composizione chimica lorda (g/100 g) e pH di campioni di formaggio prevalentemente fresco per trattamento (T1-T4) e lotto (B1-B3) all’interno dei trattamenti. a) Trattamenti: alimentazione con insilati senza additivi (T1-UNTR), con inoculazione mediante coltura starter (T2-INOC e T4-INOC) e con trattamento acido (T3-ACID). b) A causa di incomprensioni, alcuni campioni non sono stati prelevati/analizzati e i valori contrassegnati con (-) risultano mancanti. c) Lactococcus lactis subsp. diacetylactis .

Microbiota dei campioni raccolti durante la produzione del formaggio

Durante la caseificazione il microbiota è cambiato drasticamente rispetto al latte crudo. La diversità alfa è rimasta invece sostanzialmente stabile tra latte fermentato, cagliata e formaggio fresco. Sono emerse alcune differenze tra trattamenti: T1-UNTR e T2-INOC, e soprattutto T4-INOC rispetto agli altri trattamenti, hanno mostrato composizioni microbiche differenti.

Figura 3 – Grafico dell’analisi delle coordinate principali della matrice di distanza UniFrac ponderata del microbiota in relazione ai trattamenti e ai punti di campionamento nel processo di caseificazione. Trattamenti: Alimentazione con insilati senza additivi (T1-UNTR), con inoculazione mediante coltura starter (T2-INOC e T4-INOC) e con trattamento acido (T3-ACID).

L’analisi delle 25 ASV più abbondanti ha evidenziato la netta dominanza di Lactococcus, seguito da Leuconostoc e Lactobacillus. Alcuni ASV di Lactobacillus erano particolarmente abbondanti nei lotti T4-INOC, mentre Enterobacteriaceae non classificate mostravano valori elevati soprattutto in alcuni lotti di formaggio fresco.

Figura 4 – Le 25 principali varianti di sequenza dell’amplicone (ASV) nel latte fermentato, nella cagliata e nel formaggio fresco per trattamento (T1-T4) e lotto (B1-B3) all’interno del trattamento. La scala dell’asse Y è stata tagliata al 70% di abbondanza relativa per una maggiore risoluzione. Trattamenti: Alimentazione con insilati senza additivi (T1-UNTR), con inoculazione mediante coltura starter (T2-INOC e T4-INOC) e con trattamento acido (T3-ACID).

Microbiota e caratteristiche qualitative del formaggio durante la stagionatura

Durante la stagionatura il microbiota dei formaggi variava progressivamente, ma i formaggi ottenuti dai diversi trattamenti di insilato mostravano una ampia sovrapposizione. Le differenze tra i lotti erano spesso maggiori di quelle tra i trattamenti, indicando un’influenza più importante del lotto rispetto al tipo di insilato. T2-INOC mostrava alcune differenze nelle prime fasi della stagionatura; a 18 e 22 mesi, invece, non sono state rilevate differenze significative tra i trattamenti.

Le ASV più abbondanti durante la stagionatura appartenevano soprattutto a Lactococcus e Leuconostoc. Alcuni lotti mostravano inoltre un aumento di Lactobacillus. Le Enterobacteriaceae non classificate erano presenti soprattutto in alcuni lotti e a livelli variabili.

Figura 5 – Le 10 principali varianti di sequenza dell’amplicone (ASV) nella coltura starter e nei formaggi durante il processo di stagionatura, per trattamento (T1-T4) e lotto (B1-B3) all’interno del trattamento in diverse fasi di maturazione. La scala dell’asse Y è stata tagliata al 40% di abbondanza relativa per una maggiore risoluzione. Trattamenti: Alimentazione con insilati senza additivi (T1-UNTR), con inoculazione mediante coltura starter (T2-INOC e T4-INOC) e con trattamento acido (T3-ACID).

A 22 mesi, il confronto tra PCR standard e PCR con PMA ha evidenziato differenze nella rappresentazione dei batteri vitali: Lactococcus risultava sovrarappresentato quando veniva incluso anche il DNA delle cellule morte, mentre Leuconostoc e Lactobacillus risultavano sottorappresentati.

I punteggi sensoriali erano complessivamente bassi, ma aumentavano con la stagionatura. L’aroma tipico del Västerbotten era poco intenso, mentre erano relativamente pochi i sapori sgradevoli; per la consistenza sono stati segnalati problemi di struttura sabbiosa.

Trasferimento dei batteri lattici dal latte al formaggio

L’analisi degli ASV appartenenti ai batteri lattici ha permesso di identificare quelli presenti sia nel latte crudo sia nel formaggio a 22 mesi. Nel complesso si osservava una diminuzione dell’abbondanza relativa dei LAB lungo la catena di trasformazione. Le principali eccezioni erano Lactobacillus (5f86a), Lactococcus (dd41a) e Leuconostoc (4b97e), cioè ASV riconducibili alla coltura starter, che aumentavano nel formaggio rispetto al latte in tutti i lotti. Anche alcuni ASV di Lactobacillus e Leuconostoc mostravano aumenti in specifici trattamenti e lotti.

Figura 6 – Varianti di sequenza dell’amplicone (ASV) appartenenti ai batteri lattici, ovvero all’ordine Lactobacillales, presenti sia nel latte crudo che nei formaggi a 22 mesi di stagionatura. Il filtraggio ha incluso solo le ASV presenti in entrambe le repliche in entrambi i punti di campionamento, per lotto. Trattamenti di alimentazione con insilati senza additivi (T1-UNTR), con inoculazione mediante coltura starter (T2-INOC e T4-INOC) e con trattamento acido (T3-ACID)

Per gli ASV di LAB presenti in entrambi i punti di campionamento, si è osservata una tendenza generale alla diminuzione dell’RA dal latte crudo ai formaggi finali. Gli unici ASV che hanno mostrato un aumento dell’RA nel formaggio sono stati Lactobacillus (5f86a), Lactococcus (dd41a) e Leuconostoc (4b97e), ovvero gli ASV che costituiscono la coltura starter, e questo è stato il caso in tutti i lotti. Inoltre, Lactobacillus (8a306) ha mostrato un aumento dell’RA nel trattamento T4-INOC e Leuconostoc (46006) ha mostrato un aumento dell’RA in tutti i lotti tranne B1 e B2 di T1-UNTR e B1 di T2-INOC.

Discussione

Microbiota nei diversi materiali

Il latte crudo presenta la maggiore diversità microbica, con molti generi batterici presenti a basse concentrazioni. La conta batterica totale era generalmente inferiore a 5.000 batteri/ml.

Durante la caseificazione e la stagionatura il microbiota cambia: Lactococcus domina nelle prime fasi, mentre durante la stagionatura aumentano Leuconostoc e Lactobacillus e diminuisce Lactococcus. La successione è legata alle diverse condizioni di pH e alla competizione tra i batteri.

Il trattamento con PMA ha mostrato che una parte del DNA di Lactococcus presente nel formaggio stagionato deriva da cellule morte. Dopo il trattamento, Lactobacillus risultava invece più abbondante, indicando una maggiore presenza di cellule vive di Lactobacillus.

Il microbiota del latte variava in misura minore

I diversi trattamenti alimentari hanno prodotto variazioni molto limitate nel microbiota del latte crudo. La bassa carica batterica e l’elevata diversità erano coerenti con altri studi sul latte crudo svedese.

L’elevata presenza di Lactococcus e Leuconostoc nel latte campionato presso il caseificio potrebbe essere dovuta a contaminazioni o arricchimenti batterici durante il trasporto e la permanenza nel caseificio. Le procedure di pulizia degli impianti possono infatti favorire l’accumulo di alcuni batteri, in particolare Acinetobacter e Lactococcus.

Conteggio batterico e microbiota durante la produzione del formaggio

Il trattamento T4-INOC ha prodotto un microbiota differente, caratterizzato da meno Lactococcus e più Leuconostoc e Lactobacillus. Tuttavia, poiché il microbiota del latte era simile tra i trattamenti, queste differenze sono probabilmente dovute a fattori legati al processo di caseificazione e all’ambiente del caseificio, piuttosto che all’alimentazione.

La presenza di Enterobacteriaceae in alcuni formaggi, soprattutto T1-UNTR, è stata probabilmente collegata a insufficiente pulizia delle attrezzature, formazione di biofilm o contaminazione da parte degli operatori.

Nei lotti T2-INOC, invece, Lactococcus lactis era particolarmente dominante, raggiungendo oltre il 90% in alcuni campioni, con una minore variabilità tra i lotti.

La coltura starter DVS, oltre a Lactococcus e Leuconostoc, conteneva circa il 10% di Lactobacillus. Nelle prime fasi della fermentazione Lactococcus dominava, mentre Leuconostoc compariva già nel latte fermentato.

Microbiota e caratteristiche qualitative del formaggio durante la stagionatura

La coltura starter continuava a dominare il microbiota anche nelle fasi avanzate della stagionatura. Fino a 14 mesi, i formaggi T2-INOC presentavano un microbiota più uniforme rispetto agli altri trattamenti; successivamente le differenze tra i trattamenti diminuivano.

Nei formaggi a lunga stagionatura ci si aspetterebbe una forte presenza di NSLAB, soprattutto Lactobacillus, importanti per lo sviluppo dell’aroma. Il trattamento con PMA ha dimostrato che Lactobacillus era in realtà più abbondante tra i batteri vivi di quanto apparisse dall’analisi del DNA totale, raggiungendo circa il 15-30% a 22 mesi.

Anche Lactococcus e Leuconostoc rimanevano importanti durante la stagionatura. La presenza di Enterobacteriaceae in alcuni formaggi stagionati sembra invece derivare da contaminazioni avvenute nelle prime fasi della produzione.

Batteri lattici presenti sia nel latte crudo che nel formaggio a 22 mesi

Sono stati individuati nel latte crudo e nei formaggi stagionati soprattutto Lactococcus, Leuconostoc e Lactobacillus, gli stessi principali componenti della coltura starter.

Non è però possibile stabilire con certezza che i ceppi presenti nel latte e nel formaggio siano identici. La loro presenza potrebbe dipendere anche da contaminazioni del latte provenienti dall’ambiente del caseificio.

Alcuni altri ASV di Lactobacillus e Lactococcus erano presenti solo in determinati lotti. Aerococcus è stato trovato sia nel latte sia nel formaggio, ma con abbondanza generalmente maggiore nel latte crudo.

Discussione generale

Il risultato principale è che i batteri presenti nei formaggi finali provenivano soprattutto dalla coltura starter, mentre il contributo della flora microbica del latte crudo aziendale sembrava più limitato.

Gli NSLAB, importanti per la maturazione e lo sviluppo dell’aroma dei formaggi a lunga stagionatura, risultavano poco rappresentati. I Lactobacillus presenti nel formaggio stagionato sembravano infatti derivare principalmente dalla coltura starter.

La lenta maturazione e la consistenza sabbiosa osservate potrebbero essere associate a una lenta degradazione delle proteine e alla scarsa presenza di NSLAB.

In conclusione, lo studio suggerisce che le moderne pratiche igieniche, sia in allevamento sia in caseificio, insieme ai cambiamenti nelle colture starter, potrebbero aver ridotto il microbiota NSLAB del latte crudo. Questo potrebbe avere conseguenze sulla maturazione e sulle caratteristiche sensoriali dei formaggi a lunga stagionatura.

Conclusioni

Gli effetti attesi della composizione del microbiota sul latte crudo, derivanti da una prova di alimentazione con vacche da latte alimentate con diversi insilati, sono risultati assenti. Al contrario, la principale variazione del microbiota durante la caseificazione e la stagionatura del formaggio era correlata ai singoli lotti di formaggio, non al microbiota del latte crudo causato dall’alimentazione. Il microbiota del formaggio era dominato dai batteri presenti nella coltura starter anche nelle fasi avanzate della stagionatura (22 mesi).

Fonte: “Changes in microbiota during the cheese making process – from the rawmilk to the final cheeses”, Thomas M. Eliasson, Åse Lundh, Annika Hojer, Karin Hallin Saed´en, Mårten Hetta, Li Sun. International Dairy Journal, January 2026, 106430, Volume 172. Https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2025.106430.