Quantificazione rapida e simultanea di cellule vitali di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus nello yogurt mediante citometria a flusso combinata con nuove sonde oligonucleotidiche

Introduzione

Lo yogurt è uno dei più antichi prodotti lattiero-caseari fermentati e si ottiene attraverso la fermentazione del latte operata principalmente da Lactobacillus e Streptococcus thermophilus. L’attività metabolica sinergica di questi batteri attiva la fermentazione omolattica e porta alla produzione di metaboliti come lattato, peptidi bioattivi, esopolisaccaridi e acidi grassi a catena corta, composti che contribuiscono a migliorare digeribilità, biodisponibilità dei minerali e funzionalità intestinale dello yogurt. Per questo motivo la conta delle cellule vitali rappresenta un parametro essenziale per valutare qualità nutrizionale e funzionale del prodotto.

Il rapporto di inoculo tra i due microrganismi influenza direttamente la cinetica di fermentazione, la velocità di acidificazione, la viscosità, la capacità di ritenzione idrica e la formazione di composti aromatici. Inoltre, determina il grado di post-acidificazione e il tempo necessario per completare la fermentazione. Durante il processo fermentativo, le variazioni nella popolazione microbica riflettono l’adattamento dei batteri alle condizioni fisico-chimiche del substrato e rappresentano un indicatore utile per ottimizzare i parametri di processo. Nei prodotti finiti, gli standard qualitativi richiedono generalmente una concentrazione minima di circa 10⁶ UFC/mL di cellule vitali per garantire stabilità e qualità durante la conservazione.

Il metodo tradizionale di conta su piastra è considerato il riferimento analitico, ma presenta tempi di risposta lunghi e una limitata capacità di distinguere in modo selettivo le due specie in matrici complesse come lo yogurt. Negli anni sono stati sviluppati diversi approcci alternativi, tra cui tecniche immunologiche, metodi di ibridazione molecolare e sistemi basati su PCR quantitativa, che consentono una maggiore specificità ma presentano limitazioni operative, come la necessità di estrazione degli acidi nucleici, l’uso di curve standard o una precisione quantitativa non sempre ottimale.

Un approccio promettente, descritto in questo articolo pubblicato su  Journal of Dairy Science nel 2026, è rappresentato dalla citometria a flusso, soprattutto se combinata con tecniche fluorescenti. Questo metodo consente il conteggio rapido delle cellule vitali, ma nella sua configurazione standard non permette di distinguere specie batteriche specifiche. Per superare questo limite, sono state sviluppate nuove sonde oligonucleotidiche fluorescenti progettate su sequenze di rRNA 16S specifiche per Lactobacillus e S. thermophilus. L’integrazione di queste sonde con la citometria a flusso ha portato allo sviluppo del sistema NOP-FC, capace di rilevare e quantificare simultaneamente le cellule vitali dei due batteri.

Il metodo prevede l’ottimizzazione del pretrattamento del campione, delle condizioni di ibridazione delle sonde e dei parametri di analisi citometrica. I risultati hanno dimostrato che questa tecnica consente una quantificazione rapida, specifica e simultanea delle due specie batteriche in diverse tipologie di yogurt, sia industriali sia artigianali. In prospettiva, il sistema NOP-FC rappresenta uno strumento efficace per il monitoraggio della fermentazione e per il controllo della qualità dei prodotti fermentati a base di latte.

Materiali e metodi

Prodotti chimici e reagenti

Lo studio ha impiegato diversi reagenti chimici necessari per le analisi microbiologiche e per lo sviluppo del sistema di rilevamento. Tra i principali composti utilizzati figurano Tris-HCl, EDTA, Triton X-100 e SDS, oltre a formammide, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), etanolo e alcol isopropilico. Sono stati inoltre utilizzati coloranti fluorescenti come ioduro di propidio e SYTO 9, fondamentali per la valutazione della vitalità cellulare mediante tecniche di fluorescenza. Per la preparazione dei campioni di latte è stato impiegato anche un kit per la purificazione microbica rapida, utile per isolare e concentrare i microrganismi presenti nella matrice lattiero-casearia.

Ceppi batterici e condizioni di crescita

Per la validazione del metodo sono stati analizzati 48 ceppi batterici, comprendenti 5 ceppi di Streptococcus thermophilus e 11 ceppi di Lactobacillus utilizzati per valutare l’inclusività delle sonde, mentre altri 32 ceppi sono stati impiegati per testarne l’esclusività. Tra i ceppi di riferimento utilizzati nelle prove fermentative figurano S. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, scelto come rappresentante del genere Lactobacillus. I microrganismi sono stati coltivati a 37 °C in terreni specifici: brodo di soia tripticase per S. thermophilus e terreno anaerobico MRS per i lattobacilli.

Le cellule batteriche sono state raccolte durante la fase di crescita logaritmica mediante centrifugazione e successivamente risospese in PBS. La vitalità cellulare è stata valutata sia con metodi tradizionali basati su piastra sia tramite citometria a flusso con doppia colorazione PI-SYTO. Per verificare l’accuratezza dei metodi sono state preparate sospensioni contenenti cellule vitali e cellule inattivate: queste ultime sono state ottenute trattando i batteri con alcol isopropilico al 75% per 30 minuti, seguito da centrifugazione e risospensione in PBS, così da disporre di campioni standardizzati di cellule non vitali utili alla validazione del sistema analitico.

Progettazione e sintesi delle sonde oligonucleotidiche (NOP)

Le sequenze di rRNA 16S di Streptococcus thermophilus e di diversi ceppi di Lactobacillus sono state recuperate da database specializzati di sequenze ribosomiali e confrontate con numerosi ceppi di riferimento. L’analisi comparativa ha identificato la regione V1–V2 dell’rRNA 16S come bersaglio ideale per la progettazione delle sonde. Attraverso strumenti bioinformatici di allineamento e verifica della specificità sono state selezionate due sonde altamente selettive: S-NOP per S. thermophilus e L-NOP per Lactobacillus. Le sonde sono state sintetizzate e marcate con fluorofori differenti (Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647) per consentire la rilevazione simultanea tramite fluorescenza. La loro specificità è stata successivamente confermata mediante ibridazione fluorescente in situ.

Preparazione in laboratorio dei campioni di yogurt fermentato

I campioni di yogurt sono stati prodotti utilizzando latte scremato come substrato, attraverso un processo in tre fasi: preparazione del latte sterile, inoculo delle colture starter e fermentazione. Il latte è stato preriscaldato, addizionato con saccarosio al 6,5%, pastorizzato a 95 °C per 5 minuti e successivamente raffreddato a 42 °C. Le colture starter utilizzate sono state S. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, inoculate sia singolarmente sia in sistema binario con popolazione iniziale ≥10⁷ UFC/mL. La fermentazione è stata condotta a 42 °C con monitoraggio del pH ogni due ore fino al raggiungimento di pH 4,6. I campioni sono stati quindi raffreddati rapidamente e maturati a 4 °C per 24 ore.

Preparazione di campioni di yogurt con aggiunta controllata di batteri

Per valutare l’efficienza di recupero delle cellule batteriche è stato necessario preparare campioni con quantità note di microrganismi. Poiché lo yogurt commerciale contiene già diversi batteri lattici, sono stati utilizzati campioni fermentati in laboratorio con un singolo ceppo. In questo modo è stato possibile aggiungere quantità note di L. bulgaricus o S. thermophilus e misurare con precisione il tasso di recupero. Le sospensioni batteriche sono state centrifugate e il pellet ottenuto è stato aggiunto a piccole aliquote di yogurt per la preparazione dei campioni sperimentali.

Pretrattamento dei campioni di yogurt

I campioni sono stati diluiti con PBS (rapporto 1:9) e trattati con un reagente per la purificazione microbica rapida del latte, utile per rimuovere lipidi e componenti interferenti. Dopo omogeneizzazione e centrifugazione, lo strato lipidico è stato eliminato e il pellet microbico è stato risospeso in PBS per ottenere sospensioni batteriche purificate destinate alle analisi successive.

Metodo NOP-FC per la rilevazione dei batteri

La quantificazione simultanea dei microrganismi è stata effettuata mediante un sistema combinato di sonde oligonucleotidiche fluorescenti e citometria a flusso. In primo luogo, le cellule vitali sono state trattate con PMA per distinguere le cellule vive da quelle morte. Successivamente le cellule sono state fissate, permeabilizzate con lisozima e sottoposte a ibridazione con le sonde specifiche S-NOP e L-NOP. Dopo il lavaggio, le cellule marcate sono state analizzate con citometro a flusso dotato di laser a 488 nm e 638 nm. Le cellule vitali di S. thermophilus sono state identificate tramite fluorescenza verde, mentre quelle di Lactobacillus tramite fluorescenza rossa. La quantificazione simultanea è stata ottenuta tramite analisi citometrica continua e definizione di specifiche regioni di gating nei grafici a doppio parametro.

Metodo di conta basato su piastra

Come metodo di riferimento è stata utilizzata la tradizionale semina su piastra. Dopo diluizioni seriali del campione, le aliquote sono state inoculate in terreni selettivi: agar MRS per Lactobacillus e terreno M17 per S. thermophilus. Le piastre sono state incubate a 42 °C per 48 ore e le colonie sviluppate sono state conteggiate per determinare la concentrazione di cellule vitali.

Analisi metabolomica non mirata dello yogurt

Per comprendere le cause delle variazioni nella popolazione batterica è stata condotta un’analisi metabolomica non mirata. I campioni di yogurt sono stati sottoposti a estrazione con una miscela di acetonitrile e metanolo, seguita da centrifugazione e concentrazione del surnatante. I metaboliti sono stati analizzati mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa (LC-MS). La separazione cromatografica è stata effettuata con colonna UPLC, mentre l’analisi di massa è stata condotta con uno spettrometro Orbitrap dotato di ionizzazione elettrospray in modalità positiva e negativa, consentendo l’identificazione di un ampio spettro di metaboliti presenti nello yogurt.

Elaborazione dei dati e analisi statistica

I dati metabolomici grezzi sono stati convertiti e processati con software dedicati per l’allineamento dei picchi, la correzione del tempo di ritenzione e la normalizzazione delle aree. L’identificazione dei metaboliti è stata effettuata confrontando gli spettri con database metabolomici pubblici. Successivamente sono state applicate analisi statistiche multivariate, tra cui analisi delle componenti principali e modelli discriminanti, per individuare differenze metaboliche tra i gruppi. I metaboliti significativamente differenti sono stati selezionati in base a valori statistici di significatività e variazione relativa.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e i risultati espressi come media ± deviazione standard. Le differenze tra gruppi sono state valutate mediante test statistici appropriati, considerando significativa una probabilità P < 0,05.

Risultati e discussione

Principio del metodo NOP-FC

Il metodo NOP-FC è stato sviluppato per rilevare simultaneamente le cellule vitali di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus nello yogurt. Poiché la matrice yogurt contiene macromolecole come globuli di grasso e proteine che possono interferire con la citometria a flusso, i campioni sono stati inizialmente sottoposti a pretrattamento per ottenere sospensioni batteriche chiarificate. La distinzione tra cellule vive e morte è stata ottenuta mediante PMA, un colorante che penetra solo nelle cellule con membrana danneggiata e si lega agli acidi nucleici delle cellule morte, producendo fluorescenza rossa rilevabile nel canale citometrico 488-RFL. Il PMA residuo è stato successivamente inattivato mediante irradiazione luminosa per evitare interferenze nelle fasi successive.

Per l’identificazione specie-specifica sono state utilizzate sonde oligonucleotidiche mirate alle regioni ipervariabili del gene 16S rRNA di Lactobacillus e S. thermophilus. L’ingresso e il legame delle sonde sono stati garantiti tramite fissazione cellulare, marcatura fluorescente e lavaggio. Il principio del metodo è illustrato in Figura 1.

Figura 1 – Principio del rilevamento multiplex di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus nello yogurt mediante NOP-FC.

L’analisi citometrica ha permesso di distinguere popolazioni batteriche diverse: cellule morte (fluorescenza PMA), Lactobacillus vitali (fluorescenza rossa della sonda) e S. thermophilus vitali (fluorescenza verde). Le immagini citometriche e di microscopia a fluorescenza che confermano la specificità della colorazione sono riportate in Figura 2.

Figura 2 – Risultati della citometria a flusso e della microscopia a fluorescenza di Lactobacillus (A₁–H₁) e S. thermophilus (A₂–H₂) dopo colorazione. (A) Cellule vitali e (B) cellule morte senza trattamento. (C) Cellule di Lactobacillus vitali e (D) cellule morte dopo trattamento con L-NOP. (E) Cellule vitali e (F) cellule morte dopo trattamento con PMA. (G) Cellule vitali e (H) cellule morte trattate con L-NOP e PMA.

Pretrattamento del campione e recupero batterico

L’osservazione microscopica dei campioni prima e dopo il trattamento ha evidenziato una significativa riduzione delle impurità e delle particelle interferenti, migliorando la qualità della sospensione batterica (Figura 3A-F). Il recupero dei microrganismi dopo il pretrattamento è stato valutato confrontando campioni di yogurt e sospensioni batteriche in PBS. I risultati hanno mostrato tassi di recupero pari a circa 93,41% per Lactobacillus e 92,09% per S. thermophilus, confermando l’efficacia del protocollo (Figura 3G).

Figura 3 – Valutazione della fattibilità del protocollo di pretrattamento per l’analisi di Lactobacillus (A–C) e S. thermophilus (D–F) nei campioni di yogurt mediante metodo NOP-FC. Immagini in campo chiaro del campione di yogurt prima (A, D), durante (B, E) e dopo (C, F) il pretrattamento. (G) Controllo con Lactobacillus e Streptococcus thermophilus in PBS senza pretrattamento e recupero nei campioni di yogurt dopo pretrattamento (n = 3). Dati espressi come media ± DS.

Specificità del metodo NOP-FC

La specificità delle sonde è stata testata su 48 ceppi batterici. La sonda S-NOP ha riconosciuto selettivamente i 5 ceppi di S. thermophilus, mentre L-NOP ha identificato gli 11 ceppi target di Lactobacillus. Nessuna delle due sonde ha mostrato reattività con gli altri 32 ceppi non bersaglio, dimostrando un’elevata specificità analitica.

Ottimizzazione della colorazione NOP

L’efficacia dell’ibridazione delle sonde dipende da parametri critici quali temperatura, concentrazione e tempo di incubazione. L’ottimizzazione sperimentale ha identificato 46 °C come temperatura ottimale di ibridazione per entrambi i batteri. La concentrazione ottimale delle sonde è risultata pari a 7 ng/μL per S-NOP e 8 ng/μL per L-NOP. Inoltre, un tempo di incubazione di 90 minuti ha garantito una colorazione completa senza perdita di efficienza.

Valutazione delle prestazioni del metodo NOP-FC

Le prestazioni del metodo sono state verificate analizzando miscele batteriche con differenti proporzioni tra L. bulgaricus e S. thermophilus. L’analisi citometrica ha mostrato che le proporzioni rilevate coincidevano con quelle impostate sperimentalmente, dimostrando l’accuratezza della quantificazione simultanea (Figura 4).

Figura 4 – Analisi NOP-FC di una miscela di Streptococcus thermophilus e Lactobacillus in diversi rapporti (Streptococcus thermophilus : Lactobacillus). Il campione senza aggiunta di batteri è servito da controllo: (A) 0:0; (B) 1:0; (C) 7:3; (D) 5:5; (E) 3:7; (F) 0:1.

La capacità del metodo di distinguere cellule vive e morte è stata valutata combinando la colorazione PMA con NOP-FC su miscele con rapporti vitali/morti variabili. I risultati hanno mostrato una forte correlazione con i rapporti teorici (Figura 5).

Figura 5 – Risultati NOP-FC di campioni seriali con diverse proporzioni di cellule di Lactobacillus (A₁–E₁) e Streptococcus thermophilus (A₂–E₂), morte e vitali. Le percentuali di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus morti e vitali, a diverse concentrazioni e proporzioni, sono state miscelate secondo rapporti 1:0, 7:3, 5:5, 3:7 e 0:1.

La ripetibilità del metodo è stata verificata su cinque campioni paralleli, mostrando deviazioni standard relative inferiori al 5% per entrambi i batteri (Figura 6A). Inoltre, il confronto con il metodo tradizionale su piastra ha evidenziato una forte correlazione lineare (R² = 0,99) tra le due tecniche (Figura 6B) e un’eccellente concordanza confermata dall’analisi di Bland-Altman (Figura 6C). I limiti di rilevamento sono risultati pari a circa 10⁴ cellule/mL, valori pienamente compatibili con gli standard industriali dello yogurt.

Figura 6 – (A) Valutazione della ripetibilità e della capacità di quantificazione del metodo NOP-FC. (B) Relazione tra la conta mediante citometria a flusso e il metodo su piastra per Lactobacillus e Streptococcus thermophilus; dati espressi come media ± DS (n = 3). (C) Analisi di Bland-Altman tra metodo NOP-FC e metodo su piastra per la quantificazione delle cellule vitali di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus (scala log₁₀ su entrambi gli assi). Le barre di errore rappresentano l’intervallo di confidenza al 95% dei limiti di concordanza (media ± 1,96 × DS).

Applicazione del metodo NOP-FC nei prodotti di yogurt commerciale

Il metodo è stato applicato a 10 campioni di yogurt commerciale, confrontando i risultati con quelli ottenuti mediante il metodo su piastra. È stata osservata una correlazione positiva significativa tra i due approcci, confermando l’affidabilità del metodo NOP-FC per il controllo di qualità dei prodotti lattiero-caseari.

Applicazione del metodo NOP-FC nella fermentazione dello yogurt

Per valutare l’utilità del metodo nel monitoraggio della fermentazione sono stati analizzati quattro sistemi fermentativi: fermentazione con Lactobacillus, con S. thermophilus, con entrambi i ceppi e con doppia coltura senza saccarosio (Figura 7A). Il numero di cellule vitali è stato monitorato ogni ora per cinque ore mediante NOP-FC e metodo su piastra. I risultati dei due metodi sono risultati comparabili (Figura 7B e 7C).

Figura 7 – Risultati del rilevamento di cellule di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus in campioni di yogurt fermentato in laboratorio. (A) Gruppi con diverse condizioni di fermentazione. (B) Rilevamento di Lactobacillus vitale durante la fermentazione mediante NOP-FC e metodo su piastra. (C) Rilevamento di Streptococcus thermophilus vitale durante la fermentazione mediante NOP-FC e metodo su piastra. Le lettere (a–e) indicano differenze significative (P < 0,05, test di Duncan) tra i tempi di fermentazione nelle stesse condizioni; lettere diverse indicano differenze significative, le stesse indicano assenza di differenze (n = 3). Dati espressi come media ± DS.

Nei sistemi di cocultura i due batteri hanno raggiunto il picco di crescita più rapidamente rispetto ai sistemi a ceppo singolo, evidenziando un effetto sinergico. Inoltre, la presenza di saccarosio ha favorito in particolare la crescita di S. thermophilus.

Analisi metabolomica e interpretazione delle differenze fermentative

Per comprendere i meccanismi alla base delle differenze di crescita sono stati analizzati campioni di yogurt mediante metabolomica non mirata. L’analisi ha evidenziato variazioni significative nei percorsi metabolici tra i sistemi di fermentazione singola e doppia, inclusi metabolismo degli aminoacidi, ciclo dell’acido tricarbossilico e trasporto transmembrana (Figura 8). La cocultura ha migliorato l’efficienza metabolica grazie a fenomeni di cross-feeding e complementazione metabolica.

Figura 8 – Analisi delle cellule vitali di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus e dei percorsi metabolici in diverse condizioni di fermentazione. (A, B) Le cellule batteriche vitali sono state determinate mediante NOP-FC e metodo su piastra, mostrando (A) le variazioni di Lactobacillus e (B) di Streptococcus thermophilus prima e dopo la fermentazione; i valori sopra le barre indicano le variazioni relative post- vs pre-fermentazione (n = 3). (C–E) Analisi di arricchimento KEGG dei metaboliti differenzialmente espressi, con i 20 percorsi più significativi nei confronti tra (C) gruppo L vs SL, (D) gruppo S vs SL e (E) gruppo O vs SL.

Monitoraggio della durata di conservazione dello yogurt

Il metodo NOP-FC è stato utilizzato anche per monitorare la vitalità batterica durante la conservazione dello yogurt per 14 giorni a 4 °C. È stata osservata una fase iniziale di crescita seguita da una progressiva riduzione della popolazione batterica dovuta all’esaurimento dei nutrienti. L. bulgaricus ha mostrato un declino più rapido rispetto a S. thermophilus (Figura 9). I risultati ottenuti con NOP-FC sono risultati coerenti con quelli del metodo su piastra.

Figura 9 – Risultati del rilevamento di cellule di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus in yogurt fermentato in laboratorio e conservato a 4 °C per 14 giorni. (A) Rilevamento di Lactobacillus vitale mediante NOP-FC e metodo su piastra. (B) Rilevamento di Streptococcus thermophilus vitale mediante NOP-FC e metodo su piastra. Le lettere (a–f) indicano differenze significative (P < 0,05, test di Duncan) tra i tempi di conservazione nelle stesse condizioni; lettere diverse indicano differenze significative, mentre lettere uguali indicano assenza di differenze (n = 3). Dati espressi come media ± DS.

Vantaggi e limiti del metodo NOP-FC

Il metodo sviluppato consente la quantificazione rapida e simultanea delle principali colture starter dello yogurt con un tempo totale di analisi di circa 2 ore, molto inferiore rispetto alle tecniche tradizionali. L’elevata specificità delle sonde e la precisione della citometria a flusso permettono una conta cellulare accurata e altamente ripetibile.

Tuttavia, il metodo presenta alcune limitazioni: la sensibilità è ottimale solo per concentrazioni superiori a circa 10⁴ cellule/mL e richiede citometri a flusso dotati di laser specifici (488 e 638 nm). Inoltre, i costi strumentali possono limitarne l’utilizzo in contesti con risorse ridotte. Nonostante ciò, i continui progressi tecnologici nella citometria a flusso potrebbero rendere questa tecnica sempre più accessibile e applicabile nel controllo di qualità dei prodotti lattiero-caseari fermentati.

Conclusioni

Questo studio ha sviluppato un test multiplex NOP-FC in grado di quantificare rapidamente le cellule vitali di Lactobacillus e Streptococcus thermophilus nello yogurt in circa 2 ore.

Il metodo proposto ha evidenziato diversi vantaggi analitici e applicativi. In primo luogo, ha mostrato elevate prestazioni metodologiche, tra cui un’ottima efficienza di recupero delle cellule batteriche, un’elevata specificità di legame delle sonde, una forte correlazione con il metodo tradizionale basato su piastra e un’eccellente ripetibilità dei risultati.

In secondo luogo, il sistema NOP-FC ha dimostrato una notevole robustezza operativa e una buona adattabilità alle esigenze dell’industria lattiero-casearia. Il metodo consente infatti una quantificazione rapida e accurata dei batteri vitali target nei prodotti di yogurt commerciale, risultando al contempo flessibile rispetto a differenti scenari di analisi. Durante il processo di fermentazione permette il monitoraggio in tempo reale delle dinamiche microbiche, mentre nel periodo di conservazione mantiene un’elevata sensibilità di rilevazione delle popolazioni batteriche.

Nel complesso, questo approccio offre una soluzione analitica integrata capace di supportare l’intera filiera dello yogurt, dalla fase di produzione fino al consumo. Il metodo rappresenta quindi una base tecnica affidabile per il controllo di qualità lungo tutto il processo produttivo.

Nel complesso, i risultati ottenuti indicano che il metodo NOP-FC sviluppato in questo studio possiede un significativo potenziale di applicazione nei sistemi di produzione, controllo e supervisione dell’industria lattiero-casearia.

Fonte: “Rapid and simultaneous quantification of viable Lactobacillus and Streptococcus thermophilus cells in yogurt by flow cytometry combined with novel oligonucleotide probes”, Xiaoyu Cai, Siyuan Liu, Ziquan Wang, Meng Wang, Wei Zhang,  Zhiwei Sui. J. Dairy Sci. 109:2293–2312. https://doi.org/10.3168/jds.2025-27506.

 Autore: Elisabetta Simonetti