Impatto delle tecnologie di pastorizzazione non termica sul contenuto di vitamina B12 nel latte

Introduzione

Il latte rappresenta una delle principali fonti alimentari di energia e nutrienti essenziali, tra cui proteine di alta qualità, grassi e micronutrienti come vitamine e minerali. Tra le vitamine, la B12 è particolarmente rilevante: sebbene presente in basse concentrazioni nel latte vaccino (circa 0,54 μg/100 g), una porzione standard può coprire oltre il 50% del fabbisogno giornaliero raccomandato. Questa vitamina è fondamentale per la sintesi del DNA e il metabolismo della metionina, e la sua carenza è un rischio soprattutto per vegani e anziani.

La vitamina B12 è presente quasi esclusivamente in alimenti di origine animale, mentre nelle piante è rara o assente. Chimicamente esiste in diverse forme (cobalamine), tutte con un nucleo centrale contenente cobalto, e solo alcune sono naturalmente presenti negli alimenti. La sua stabilità è limitata: luce, calore, pH e condizioni di conservazione possono ridurne il contenuto, anche se nel latte può essere parzialmente protetta da proteine come caseine e transcobalamina.

Gli studi sui trattamenti termici mostrano risultati variabili, ma spesso evidenziano perdite di vitamina B12, soprattutto a temperature elevate. Per questo cresce l’interesse verso tecnologie non termiche come HHP (High Hydrostatic Pressure, alta pressione idrostatica), PEF (Pulsed Electric Fields, campi elettrici pulsati) e UV-C (radiazione ultravioletta nella banda C), che inattivano i microrganismi senza l’uso del calore, riducendo potenzialmente l’impatto nutrizionale. L’HHP opera tra 100 e 1000 MPa e altera le strutture microbiche, il PEF induce elettroporazione delle membrane cellulari, mentre l’UV-C agisce danneggiando il DNA dei microrganismi.

Le evidenze sugli effetti delle tecnologie non termiche sulla vitamina B12 sono ancora limitate, soprattutto nel latte, dove la concentrazione è bassa e difficile da misurare. Le analisi moderne utilizzano metodi cromatografici avanzati dopo estrazione e purificazione dei vitameri. In questo contesto, lo studio pubblicato su Innovative Food Science & Emerging Technologies a marzo 2023, ha valutato l’effetto di HHP, PEF e UV-C sulla vitamina B12 nel latte, per comprendere la loro idoneità come alternative alla pastorizzazione e il loro impatto sulla conservazione del valore nutrizionale.

Un aspetto critico è la difficoltà analitica nella quantificazione della B12, che richiede tecniche altamente sensibili per evitare sovrastime. Le nuove metodiche permettono una valutazione più accurata dei trattamenti e della reale stabilità della vitamina nei processi tecnologici innovativi.

Nel complesso, la ricerca si inserisce nel contesto delle tecnologie non termiche emergenti, che mirano a garantire sicurezza microbiologica e qualità nutrizionale del latte, mantenendo il più possibile intatto il contenuto vitaminico.

Materiali e metodi

Materiali e sostanze chimiche

Lo studio ha utilizzato standard analitici e reagenti ad alta purezza per garantire l’accuratezza della quantificazione della vitamina B12. In particolare, la cianocobalamina (standard di riferimento), tamponi acetici, enzimi digestivi come la pepsina, acido trifluoroacetico per HPLC, solventi LC-MS (metanolo e acetonitrile) e KCN per la conversione dei vitameri sono stati impiegati nelle diverse fasi analitiche. Sono state inoltre utilizzate colonne di immunoaffinità specifiche per la vitamina B12, fondamentali per la purificazione del campione prima dell’analisi cromatografica.

Campioni di latte, composizione, pH e conducibilità

È stato utilizzato latte crudo fresco di vacche di razza Rossa Danese proveniente da un’unica azienda biologica, raccolto in condizioni controllate e conservato a 4 °C al buio. La composizione iniziale del latte (grassi, proteine, caseina, lattosio, solidi totali) è stata determinata mediante MilkoScan FT2, mentre pH e conducibilità sono stati misurati con strumenti dedicati.

I campioni sono stati suddivisi in due momenti sperimentali:

• giorno 0 per trattamenti termici
• giorno 1 per HHP, PEF e UV-C dopo conservazione a freddo

I parametri compositivi del latte nei due giorni sono riportati nella Tabella 1, che mostra la stabilità della matrice tra i due momenti sperimentali.

Tabella 1. Composizione (% p /p) del latte crudo analizzato con Milkoscan, pH e conducibilità (mS cm −1 ). I dati rappresentano i valori medi ± deviazione standard ( n = 2).

Pastorizzazione termica

La pastorizzazione convenzionale (PC) è stata utilizzata come riferimento microbiologico, applicando un trattamento HTST (High Temperature Short Time) a 71 °C per 15 secondi, seguito da rapido raffreddamento a 18 °C. Questo trattamento ha permesso di confrontare l’efficacia delle tecnologie non termiche rispetto a uno standard industriale consolidato.

Trattamento con campi elettrici pulsati (PEF)

Il PEF (Pulsed Electric Fields) è stato applicato mediante impulsi elettrici ad alta intensità su latte pre-raffreddato. Il sistema ha operato a 16 kV/cm con impulsi monopolari e frequenza di 100 Hz. Variando portata e tempo di trattamento si sono ottenute diverse intensità energetiche (29–51 kJ/L), permettendo di confrontare condizioni più o meno aggressive.

Durante il processo si è osservato un lieve aumento della temperatura del latte (da circa 4–17 °C), comunque contenuto rispetto ai trattamenti termici. Dopo il trattamento, i campioni sono stati conservati a freddo e successivamente congelati per le analisi della vitamina B12.

Trattamento ad alta pressione idrostatica (HHP)

Il trattamento HHP (High Hydrostatic Pressure) è stato applicato tra 300 e 600 MPa per 5 minuti, utilizzando acqua come fluido di pressurizzazione. Il latte è stato confezionato in condizioni controllate e trattato a temperatura moderata (circa 21–22 °C).

L’obiettivo era valutare l’effetto della pressione su microbiologia e stabilità nutrizionale senza l’uso di calore. Anche in questo caso, i campioni sono stati successivamente refrigerati e congelati per analisi successive.

Trattamento con luce UV-C

Il trattamento UV-C è stato effettuato utilizzando una sorgente LED a 265 nm. Il latte, posto in piccole aliquote in capsula di Petri, è stato agitato costantemente per garantire esposizione uniforme.

Le dosi applicate variavano da 2 a 18 mJ/cm², ottenute modificando il tempo di esposizione. Questo ha permesso di valutare l’effetto di intensità crescenti di radiazione ultravioletta sulla stabilità della vitamina B12 e sulla riduzione microbica.

Determinazione dell’inattivazione microbiologica

La carica microbica totale è stata valutata mediante semina su piastra e incubazione a 30 °C per 48 ore. I risultati sono stati espressi come CFU/mL, permettendo il confronto diretto tra latte crudo, pastorizzato e trattato con tecnologie non termiche.

Estrazione e purificazione della vitamina B12

La vitamina B12 è stata estratta tramite un protocollo modificato basato su digestione enzimatica (pepsina), conversione dei vitameri con KCN e trattamento termico controllato. Successivamente, i campioni sono stati purificati tramite colonne di immunoaffinità specifiche.

Una modifica importante del protocollo è stata l’aumento del volume di campione applicato alla colonna (25 mL invece di 10 mL), scelta per migliorare la sensibilità analitica e garantire segnali cromatografici superiori al limite di quantificazione. L’eluizione con metanolo è stata ottimizzata per aumentare il recupero della vitamina.

Analisi e quantificazione della vitamina B12 mediante LC-UV-Vis

La quantificazione è stata effettuata tramite cromatografia liquida (LC-UV-Vis) con rivelatore a diodi, utilizzando colonna C18 e fase mobile a gradiente acqua/acetonitrile con TFA. La vitamina B12 è stata identificata tramite tempo di ritenzione (6,2 min) e conferma spettrale a 361 nm.

La quantificazione è stata eseguita tramite curva di calibrazione esterna altamente lineare (R² = 0,999), garantendo elevata precisione analitica. Ogni campione è stato analizzato più volte per aumentare l’affidabilità dei dati.

Statistica

I dati sono stati analizzati mediante ANOVA con software SAS, considerando significative le differenze a p < 0,05. Il test di Duncan è stato utilizzato per confrontare le medie tra i diversi trattamenti.

Risultati e discussione

Quantificazione della vitamina B12 nel latte mediante il metodo ottimizzato

La vitamina B12 presente nel latte è stata convertita nei suoi vitameri e successivamente trasformata in cianocobalamina per la quantificazione mediante LC-UV-Vis. L’analisi cromatografica ha evidenziato un picco ben definito a 6,2 minuti, confermato tramite confronto con lo standard e dallo spettro UV caratteristico a circa 360 nm.

Il metodo ha mostrato elevata affidabilità analitica, con una curva di calibrazione altamente lineare (R² = 0,999), un limite di rilevabilità molto basso e una buona ripetibilità del tempo di ritenzione. La variabilità complessiva della procedura è risultata contenuta, con CV pari al 3% per l’estrazione, 8% per la purificazione su colonne di immunoaffinità e 2% per l’analisi cromatografica.

Sulla base di questi risultati, è stato definito un protocollo operativo ottimizzato: singola estrazione per campione, purificazione in duplicato e analisi LC-UV-Vis in duplicato per garantire solidità statistica. Il contenuto medio di vitamina B12 nel latte crudo è risultato pari a circa 0,43 μg/100 g, in linea con i valori riportati in letteratura per il latte vaccino.

Figura 1. A ) Cromatogramma tipico ottenuto per uno dei campioni di latte estratti, che mostra il picco della vitamina B12 con un tempo di ritenzione di 6,2 min. Inserito: spettro di assorbimento UV-Vis per il picco di eluizione a 6,2 min. B) Curva di calibrazione esterna ottenuta dalle soluzioni standard di cianocobalamina (R² = 0,999).

Effetti dei campi elettrici pulsati (PEF) sulla concentrazione di vitamina B12 nel latte

I trattamenti PEF applicati a diverse intensità energetiche (16 kV/cm, 29–51 kJ/L) non hanno mostrato effetti significativi sulla concentrazione di vitamina B12 rispetto al latte crudo. In nessuna delle condizioni testate il PEF ha determinato degradazione della vitamina, indicando una completa stabilità della B12 sotto stress elettrico moderato. Questo risultato è coerente con quanto riportato per altre vitamine del gruppo B in studi analoghi su latte e bevande.

La stabilità osservata può essere attribuita al limitato aumento termico durante il trattamento e alla possibile protezione esercitata dalle proteine del latte, in particolare caseine e proteine del siero, che possono legare la vitamina e ridurne la suscettibilità alla degradazione. Nel complesso, il PEF si conferma una tecnologia efficace per la riduzione microbica senza compromettere il contenuto vitaminico.

Effetti dell’HHP sui livelli di vitamina B12 nel latte

Il trattamento HHP (300–600 MPa per 5 minuti) non ha causato variazioni significative nella concentrazione di vitamina B12. La vitamina B12 si è dimostrata stabile anche sotto elevate pressioni idrostatiche, confermando che molecole piccole e strutturalmente robuste non subiscono degradazione in condizioni di compressione fisica.

La letteratura supporta questa evidenza, indicando che vitamine idrosolubili e composti a legami covalenti stabili non vengono generalmente alterati dall’HHP. Le possibili interazioni con le proteine del latte, come caseine e β-lattoglobulina, non hanno influito sul contenuto totale di vitamina B12 misurato. Pertanto, anche l’HHP fino a 600 MPa rappresenta un metodo compatibile con la conservazione della vitamina.

Effetti dei raggi UV-C sui livelli di vitamina B12 nel latte

A differenza dei trattamenti PEF e HHP, la luce UV-C ha mostrato un effetto negativo sulla vitamina B12, con una riduzione significativa alle dosi più elevate (≥ 9 mJ/cm²) e una perdita massima del 10% a 18 mJ/cm² (figura 2).

La vitamina B12 risulta fotosensibile e soggetta a degradazione indotta dalla luce UV-C, principalmente attraverso la rottura del legame tra cobalto e ligandi e successive reazioni ossidative. Questo processo porta alla formazione di prodotti non biologicamente attivi. La presenza di proteine del latte offre solo una protezione parziale, mentre le specie reattive dell’ossigeno generate durante l’irradiazione contribuiscono ulteriormente alla degradazione. Anche il pH del latte può influenzare la stabilità, ma non è sufficiente a prevenire le perdite osservate.

Fig. 2. Concentrazione media e deviazione standard della vitamina B12 nel latte determinata nel campione di controllo del giorno 1 (0) e in ciascun trattamento di A) campo elettrico pulsato, 16 kV/cm, a 29, 32, 43 e 51 kJ/L, B) alta pressione idrostatica a 300, 400, 500 e 600 MPa e C) luce UV-C a 2, 4, 9 e 18 mJ/cm² . Lettere diverse (a, b) nel caso del trattamento UV-C indicano differenze significative ( p < 0,05).

Effetti dei trattamenti non termici sulla conta microbica totale

Tabella 2. Conteggio microbico totale medio del latte dopo trattamento termico, campi elettrici pulsati, alta pressione idrostatica e UV-C (valori medi per log 10 CFU/mL ± DS, con n = 3). Il conteggio microbico del latte fresco era 5,26 ± 0,05 a e 5,28 ± 0,02 (giorno 0 e giorno 1). Lettere in apice diverse (a, b, c e d) indicano differenze significative ( p < 0,05).

I risultati microbiologici hanno mostrato differenze marcate tra i trattamenti. La pastorizzazione termica ha ridotto significativamente la carica microbica, mentre le tecnologie non termiche hanno mostrato efficacia variabile (tabella 2).

PEF e HHP hanno garantito riduzioni microbiche comparabili alla pastorizzazione in condizioni ottimali, in particolare HHP a 600 MPa e PEF a intensità intermedia (43 kJ/L).

Il PEF più energico non ha migliorato ulteriormente l’inattivazione microbica, probabilmente per effetti termici secondari e adattamenti microbici. L’HHP ha mostrato una relazione dose–risposta più chiara, con maggiore riduzione della carica batterica all’aumentare della pressione.

Al contrario, il trattamento UV-C non ha prodotto riduzioni significative della carica microbica, probabilmente a causa della limitata penetrazione della luce nel latte e della dispersione dovuta a grassi e micelle di caseina.

Nel complesso, HHP e PEF emergono come le tecnologie più promettenti per coniugare sicurezza microbiologica e conservazione della vitamina B12, mentre UV-C risulta meno efficace nelle condizioni sperimentali applicate.

Conclusioni

Questo studio ha valutato l’effetto di HHP (High Hydrostatic Pressure, alta pressione idrostatica), PEF (Pulsed Electric Fields, campi elettrici pulsati) e UV-C sulla vitamina B12 nel latte e sulla riduzione microbica.

Il trattamento HHP (300–600 MPa, 5 min) non ha alterato la vitamina B12, ma a 600 MPa ha ottenuto una riduzione microbica simile alla pastorizzazione, risultando efficace per la sicurezza del latte. Il PEF (43 kJ/L, 16 kV/cm) non ha influenzato la vitamina B12 e ha ridotto la carica microbica di circa 1 log10 CFU/mL, confermando una buona efficacia per la conservazione refrigerata. Il trattamento UV-C non ha garantito un’efficace inattivazione microbica e, alla dose massima (18 mJ/cm²), ha causato una perdita del 10% di vitamina B12.

Nel complesso, PEF e HHP risultano le tecnologie più promettenti per preservare la vitamina B12 mantenendo una discreta sicurezza microbiologica del latte.

Fonte:”Impact of non-thermal pasteurization technologies on vitamin B₁₂ content in milk”, Innovative Food Science & Emerging TechnologiesVolume 84, March 2023, 103303. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2023.103303.