Alterazioni metaboliche associate a diversi livelli di deficit energetico nelle bufale mediterranee durante la prima fase di lattazione: tipologia e ruolo delle principali frazioni lipidiche coinvolte.
A causa del crescente interesse per i prodotti alimentari di produzione bufalina si è assistito alla progressiva intensificazione dei sistemi di allevamento per tale specie. Questa intensificazione, precedentemente sconosciuta dalla bufala mediterranea, ha creato un ambiente potenzialmente stressante (De Rosa et al. 2005). Le bufale, morfologicamente e metabolicamente più simili ai bovini da carne, sono infatti sottoposte ad una gestione intensiva per massimizzare la produzione di latte, la selezione genetica e soddisfare esigenze nutrizionali più elevate. Di conseguenza, questa intensificazione ha portato ad un aumentato dell’incidenza dei disturbi metabolici (Alarcon et al. 2018).
Il periodo di transizione della bufala mediterranea italiana si caratterizza per la presenza di cambiamenti significativi nella fisiologia, nella nutrizione, nel metabolismo e nell’immunità (Gianesella et al. 2019; Fiore, E. et al. 2023). Durante questo periodo, gli aminoacidi, il glicerolo e gli acidi grassi vengono mobilitati dal muscolo scheletrico e dal tessuto adiposo (Horst et al. 2021). Ciò si traduce nel rilascio di acidi grassi non esterificati (AGNE) nel flusso sanguigno, che fungono da fonte di energia per i tessuti e gli organi periferici. Tuttavia, un’alterata funzionalità epatica o un’eccessiva lipomobilizzazione possono portare alla produzione di corpi chetonici, in particolare β-idrossibutirrato (BHB).
Mentre AGNE e BHB sono biomarcatori comunemente considerati indice di un eccessivo bilancio energetico negativo nelle vacche da latte e nelle pecore, non è stata ancora stabilita una soglia specifica dei livelli di BHB per identificare disturbi metabolici come la chetosi nella bufala (Fiore et al. 2023). Livelli elevati di AGNE e BHB possono avere un impatto negativo sulla risposta infiammatoria e sul sistema immunitario, portando potenzialmente ad altri disturbi metabolici e riproduttivi (Alarcon et al. 2018; Fiore et al. 2023).
Inoltre, la lipomobilizzazione non influisce solo sulle concentrazioni di lipidi plasmatici totali, ma anche su sue specifiche frazioni, tra cui fosfolipidi (FL), acidi grassi liberi (AGL), trigliceridi (TG) ed esteri del colesterolo (EC) (Fiore et al. 2020; Contreras et al. 2010). Ognuna di queste svolge un ruolo distinto nel metabolismo animale (Kaneko et al. 2008).
L’obiettivo del presente studio è quello di comprendere le alterazioni metaboliche associate a vari livelli di deficit energetico nelle bufale mediterranee (BM) durante la prima fase di lattazione. Per raggiungere tale scopo è stata impiegata la gascromatografia associata alla cromatografia su strato sottile (TLC-GC) per analizzare i cambiamenti nelle classi lipidiche plasmatiche.
Materiali e Metodi
Per lo studio sono state arruolate 63 bufale mediterranee (Bubalus bubalis) provenienti da un’unica azienda da latte situata nella provincia di Caserta. Queste bufale facevano parte di una mandria che ricorre a protocolli di destagionalizzazione. La dimensione del campione è stata determinata sulla base di calcoli statistici e tutte le bufale entro 50 giorni in mungitura (GIM) sono state selezionate in modo casuale tra gennaio e aprile 2019. Per ulteriori indicazioni riguardo la selezione dell’azienda oggetto di studio si rimanda al documento originale.
Le bufale mediterranee (BM) selezionate per lo studio sono state sottoposte a esame clinico completo condotto per escludere eventuali malattie coesistenti, come metriti, problemi gastrointestinali o patologie del piede. Inoltre, è stato valutato il body condition score (BCS) delle bufale utilizzando un sistema a nove punti valutando quattro aree in cui in genere gli animali immagazzinano tessuto adiposo, tra cui la regione delle costole, la regione della colonna vertebrale, i fianchi e la base della coda (Guccione et al., 2016).
A seguito dell’esame clinico, sono stati prelevati campioni di sangue attraverso la vena giugulare utilizzando una siringa da 10 ml dotata di un ago calibro 21 gauge. Una parte del sangue raccolto è stata immediatamente utilizzata per la valutazione del BHB in campo. Il restante campione ematico è stato diviso in due aliquote poste due provette, una contenente EDTA e l’altra contenente un attivatore della coagulazione. Queste provette sono state sottoposte ad un protocollo di centrifugazione in campo per ottenere campioni di plasma e siero.
I campioni di plasma e siero sono stati prontamente conservati a temperatura di refrigerazione e trasportati al laboratorio di riferimento entro un’ora dalla raccolta. Dell’aliquota complessiva 250 μL di plasma sono stati trasferiti in provette Eppendorf contenenti pirogallolo per ridurre l’ossidazione degli acidi grassi, mentre i campioni di siero sono stati trasferiti in provette Eppendorf comuni.
Durante lo studio è stato utilizzato un analizzatore multiparametrico (BT3500 Biotecnica Instruments S.p.a., Roma, Italia) per l’analisi emato-biochimica. Oltre al profilo biochimico di routine, è stata eseguita la quantificazione del BHB, degli AGNE e del glucosio.
Per identificare animali sani e animali a rischio chetosi tra le BM è stato utilizzato il valore soglia di BHB di 0,7 mmol/L come suggerito da Fiore et al., 2023 poiché, come detto in precedenza, non era disponibile un cut-off specifico dei livelli sierici di BHB per tale specie. Pertanto, è stato possibile suddividere gli animali arruolati nei seguenti gruppi:
- Gruppo animali sani (GAS) costituito da 38 BM con BHB < 0,70 mmol/L.
- Gruppo animali a rischio di chetosi (GAR-C): costituito da 25 BM con BHB ≥ 0,70 mmol/L.
Infine, per valutare l’efficacia di AG specifici come marcatori, è stata eseguita un’analisi ROC (Receiver Operating Character).
Risultati
I parametri quali BCS, numero di parti, GIM e la produzione giornaliera non hanno mostrato differenze significative tra i due gruppi. Per quanto riguarda l’analisi biochimica, le concentrazioni di BHB e aspartato aminotransferasi (AST) erano i due parametri che differivano significativamente tra i gruppi. Infatti, il GAR-C mostrava sia livelli più elevati di BHB sia di AST.
Ulteriori informazioni sono disponibili nella Tabella 1.
Tabella 1. Dati sugli animali e parametri biochimici dele BM divisi nel Gruppo GAS (Gruppo sano; BHB<0,70 mmol/L) e Gruppo GAR-C (a rischio chetosi; BHB≥0,70 mmol/L).
Per ciò che concerne le frazioni lipidiche, lo studio ha analizzato vari profili di AG. Diversi AG hanno mostrato variazioni tra i due gruppi, con il gruppo GAR-C che ha generalmente concentrazioni più elevate.
Per ulteriori informazioni si rimanda all’originale (Tabelle da 2 a 5).
Secondo il Boruta-test (Figura 1), per eseguire l’analisi ROC sono stati utilizzati n°9 AG di cui n°3 AG appartenevano a FL (C16:2 ω 4; C22:6 ω 3; e C24:1 ω 9), n°1 a AGL (C24:1 ω 9), n°3 a TG (C12:0; C16:2 ω 4; e C20:3 ω 3) e n°2 a EC (C16:1 ω 4; e C22:6 ω 3). Dalla curva ROC è stato possibile individuare (Figura 2):
- N°1 AG come buon marcatore, il C16:2 ω 4 FL (AUC: 0,80, intervallo di confidenza (CI): da 0,68 a 0,89, cut-off > 0,526, Se: 96%, Sp: 52,6%; valore p<0,001);
- N°6 AG come marcatori moderati: C24:1 ω 9 AGL (AUC: 0,76, CI: da 0,64 a 0,86, cut-off > 0,021, Se: 76%, Sp:79%; p<0,001), C20:3 ω 3 TG (AUC: 0,76, CI: da 0,63 a 0,86, cut-off ≤ 0,102, Se: 80%, Sp: 68,4%; p-value<0,001), C24:1 ω 9 FL (AUC: 0,74, CI: da 0,61 a 0,84, cut-off ≥0,374, Se: 72%, Sp: 68,4%; p-value<0,001), C12:0 TG (AUC: 0,74, CI: da 0,61 a 0,84, cut-off ≤ 0,522, Se: 56%, Sp: 86,8%; valore p<0,001), C22:6 ω 3 EC (AUC: 0,70, CI: da 0,58 a 0,81, cut-off > 0,159, Se: 60%, Sp: 84,2%; p-value=0,007) e C22:6 ω 3 FL (AUC: 0,70, CI: da 0,57 a 0,81, cut-off > 0,106, Se: 64%, Sp: 81,6%; p-value=0,008);
- N°1 AG come marcatore scarso: C16:4 ω 1 EC (AUC: 0,68, CI: da 0,55 a 0,79, cut-off > 0,095, Se: 64%, Sp: 79%; p-value=0.023).
Figura 1. Box plot dell’algoritmo decisionale di Boruta. Il box plot verde rappresenta gli acidi grassi predittivi selezionati dall’analisi di Boruta. Il box plot blu rappresenta gli acidi grassi con una funzione predittiva dubbia, mentre il box plot rosso rappresenta gli acidi grassi con funzione predittiva nulla.
Figura 2. Curva ROC degli acidi grassi predittivi elencati con funzione predittiva decrescente (Area Under the Curve (AUC)) ottenuta dall’algoritmo decisionale Boruta.
Discussione
L’inizio della lattazione innesca un aumento delle richieste metaboliche e della lipomobilizzazione, con conseguente rilascio di AG nel flusso sanguigno. Ciò influisce non solo sulle concentrazioni di lipidi plasmatici totali, ma anche sulla composizione di AG in varie frazioni lipidiche.
L’analisi biochimica ha rivelato differenze nelle concentrazioni di aspartato aminotransferasi (AST) tra i gruppi che possono suggerire lesioni epatiche o danni muscolari.
Diverse frazioni lipidiche hanno funzioni metaboliche distinte. I fosfolipidi (FL), che sono cruciali per le membrane biologiche, hanno mostrato alterazioni nella composizione di AG tra i gruppi. In particolare, alcuni acidi grassi monoinsaturi sono aumentati nel gruppo GAR-C, indicando potenziali differenze nella funzione cellulare e nella fluidità della membrana.
Gli acidi grassi liberi (AGL) svolgono un ruolo nell’ossidazione immediata e hanno mostrato variazioni tra i gruppi, con alcuni AG correlati all’infiammazione e alle risposte immunitarie. I cambiamenti nelle AG ω-3 e ω-6 potrebbero influenzare gli stati infiammatori.
I TG, il principale sito di stoccaggio per i AG a catena lunga, hanno mostrato variazioni nella composizione dei AG, incluso l’aumento dell’acido linoleico nel gruppo GAR-C. Questo cambiamento potrebbe essere correlato alla mobilizzazione energetica e al fegato grasso.
Le concentrazioni di EC in genere aumentano durante l’inizio della lattazione. Mentre i livelli di EC non differivano tra i gruppi, il profilo di AG all’interno di EC mostrava variazioni, in particolare legate all’aumento di ω-3 AG, suggerendo un adattamento metabolico.
Specifici AG di varie classi lipidiche sono stati selezionati per la loro funzione predittiva nel distinguere i livelli di BHB e sono stati confermati attraverso l’analisi ROC. L’acido esadecadienoico (C16:2 ω 4 FL) si è mostrato promettente come potenziale marcatore. La sua funzione biologica è stata studiata approfonditamente in medicina umana, in cui si è visto come questo AG agisca da agente antinfiammatorio competendo con la fosfolipasi A2 e di conseguenza inibendone l’attività (Aparna et al., 2012).
I nostri risultati hanno mostrato concentrazioni più elevate di acido esadecadienoico nelle bufale a rischio di chetosi (Gruppo GAR-C), consentendo agli autori di ipotizzare un ruolo attivo nella risposta antinfiammatoria e il potenziale sviluppo di distress e malattie legate a uno stato di deficit energetico.
Questi risultati indicano che i profili AG all’interno di diverse frazioni lipidiche possono fornire informazioni sullo stato metabolico dei MB e possono servire come marcatori per valutare la loro salute e i potenziali disturbi legati ad eventuali deficit energetici. Sono tuttavia necessarie ulteriori ricerche per comprendere meglio il significato fisiologico di questi cambiamenti di AG nella bufala.
Conclusione
In conclusione, questo studio evidenzia che i cambiamenti nel profilo degli acidi grassi plasmatici all’interno delle principali classi lipidiche possono fornire preziose informazioni sulle alterazioni metaboliche e sui meccanismi compensatori delle bufale durante la prima fase di lattazione.
Livelli di beta-idrossibutirrato superiori a 0,70 mmol/L sono collegati a cambiamenti nel profilo degli acidi grassi delle classi lipidiche, indicando potenziali influenze correlate alle risposte infiammatorie, al metabolismo epatico e alle riserve lipidiche corporee.
Tuttavia, emerge la necessità di condurre ulteriori indagini sulle malattie metaboliche nella bufala, concentrandosi in particolare sulla definizione di una soglia di beta-idrossibutirrato e sulla comprensione della manifestazione di uno stato di bilancio energetico negativo in questa specie.
Sinossi di: Lisuzzo, A.; Alterisio, M.C.; Mazzotta, E.; Ciaramella, P.; Guccione, J.; Gianesella, M.; Badon, T.; Fiore, E. Metabolic Changes Associated with Different Levels of Energy Deficits in Mediterranean Buffaloes during the Early Lactation Stage: Type and Role of the Main Lipid Fractions Involved. Animals 2023, 13, 2333. https://doi.org/10.3390/ani13142333
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