Gonfiore tardivo nei formaggi: i ceppi genetici che fanno la differenza
Perché solo alcuni ceppi di Clostridium tyrobutyricum causano il difetto di gonfiore tardivo nei formaggi a pasta dura e semidura
Clostridium tyrobutyricum è un batterio sporigeno ed è considerato uno dei principali agenti responsabili del difetto di gonfiore tardivo (LBD, late blowing defect) nei formaggi a pasta dura e semidura. Tuttavia, la capacità di C. tyrobutyricum di provocare alterazioni sembra variare a seconda del ceppo.
Poiché gli studi precedenti si sono concentrati principalmente su terreni liquidi di laboratorio o su modelli sperimentali che simulano la matrice del formaggio, in questo lavoro sono stati caratterizzati sei ceppi di C. tyrobutyricum in base alla loro capacità di provocare il difetto di gonfiore tardivo (LBD) in formaggi a cagliata lavata stagionati a 8°C e 15°C, e sono stati analizzati i dati genomici completi per identificare i marcatori genetici associati a tale difetto.
I formaggi a cagliata lavata sono stati prodotti con latte vaccino pastorizzato, inoculato individualmente con diversi ceppi di C. tyrobutyricum. Durante la stagionatura a 8°C, nessuno dei 6 ceppi valutati ha provocato nei formaggi cambiamenti compatibili con LBD (cioè accumulo di gas, formazione di fessure e produzione di acido butirrico). Tuttavia, tre dei sei ceppi testati sono stati in grado di causare LBD a 15°C; i restanti tre ceppi di C. tyrobutyricum hanno mostrato una produzione minima o nulla di gas e acido butirrico durante 160 giorni di stagionatura.
Tutti e sei i ceppi sono stati inoltre valutati in tre esperimenti separati condotti in due diversi terreni liquidi (il reinforced clostridial medium e un terreno a base di latte arricchito), per determinare la germinazione, la crescita e la formazione di gas a temperature comprese tra 8°C e 37°C, e a valori di pH compresi tra 6,9 e 4,1. Tutti i 6 ceppi valutati sono stati in grado di crescere e formare gas in un terreno liquido, in almeno una replica, a temperature e valori di pH pari rispettivamente a 12,5°C e 5,1.
Le analisi di genomica comparativa hanno mostrato che i 6 ceppi presentano un’elevata diversità genetica, senza caratteristiche genetiche specifiche che possano spiegare le differenze osservate nella capacità di causare LBD nel formaggio a cagliata lavata. Studi futuri dovranno confrontare un numero maggiore di ceppi di C. tyrobutyricum con capacità dimostrata — o assente — di causare LBD nel formaggio.
Questa capacità di causare LBD dovrà con ogni probabilità essere determinata mediante esperimenti condotti su formaggio reale, poiché i nostri risultati mostrano che la crescita e la formazione di gas nei modelli in terreno liquido non sono sempre rappresentative di quanto avviene nel formaggio.
Introduzione
La formazione indesiderata di gas nel formaggio è stata associata a diversi gruppi di microrganismi ed è spesso classificata come difetto di gonfiore precoce o tardivo (LBD, late blowing defect) a seconda della fase di produzione, stagionatura o conservazione in cui si verifica.
Alcuni dei gruppi di organismi identificati come responsabili dei difetti di gas precoci nei formaggi includono batteri coliformi, lieviti, lattococchi citrato-positivi, streptococchi resistenti al calore e lattobacilli tolleranti al sale. I due principali gruppi di organismi associati ai difetti di gas tardivi sono diversi lattobacilli eterofermentativi e specie di Clostridium.
Il difetto di gonfiore tardivo derivante dall’attività metabolica di batteri sporigeni del genere Clostridium è un difetto grave che si manifesta principalmente nei formaggi a pasta dura e semidura. Durante la stagionatura del formaggio, le endospore clostridiali possono germinare in cellule vegetative e successivamente fermentare l’acido lattico in acido butirrico, acido acetico e gas (cioè H₂ e CO₂).
Questi metaboliti provocano difetti di qualità evidenti, come fessure e crepe nel corpo del formaggio, accompagnati da odori e sapori indesiderati. L’LBD è inoltre associato a considerevoli perdite economiche nell’industria casearia, dovute alla perdita di integrità del formaggio e alla ridotta qualità sensoriale dei formaggi interessati.
La specie Clostridium tyrobutyricum è considerata uno dei principali agenti responsabili dell’LBD nei formaggi. Per il suo potenziale di deterioramento e per la sua importanza economica come organismo utilizzato nella produzione biotecnologica di acido butirrico, questa specie è stata oggetto di numerosi studi.
Molti studi hanno esplorato la diversità dei ceppi di C. tyrobutyricum utilizzando vari approcci genotipici, tra cui tipizzazione MALDI-TOF MS, analisi multilocus dei numeri variabili di ripetizioni tandem, elettroforesi su gel a campo pulsato e PCR con elementi palindromici ripetitivi. Tutti questi studi hanno portato alla principale conclusione di un’elevata diversità intra-specie all’interno di C. tyrobutyricum.
Analogamente, uno studio genomico comparativo recente su 28 ceppi di C. tyrobutyricum ha mostrato l’esistenza di un gran numero di geni accessori, poiché solo 1.179 dei 9.748 geni del pangenoma sono stati identificati come parte del genoma principale.
Sebbene l’analisi filogenetica abbia distinto gli isolati di origine lattiero-casearia (latte e formaggio) dagli altri isolati (cioè umani, fango, insilati), e l’annotazione funzionale abbia evidenziato alcune potenziali differenze funzionali, le informazioni sulla capacità di questi isolati caseari e non caseari di causare LBD erano limitate.
Gli studi che includevano la caratterizzazione fenotipica hanno rivelato un’elevata variabilità tra i ceppi di C. tyrobutyricum testati. Ad esempio, Ruusunen et al. (2012) hanno riportato che 3 dei 10 isolati testati non erano in grado di crescere a pH 5,0 e hanno riscontrato differenze superiori a dieci volte nei tassi di crescita massima tra i ceppi quando testati a valori di pH più elevati.
Inoltre, Silvetti et al. (2018) hanno dimostrato, utilizzando un terreno di latte arricchito (EM), che pH, concentrazione di sale e temperatura possono influenzare la germinazione delle spore di C. tyrobutyricum e di altre specie di clostridi legate ai latticini; ad esempio, le cellule vegetative generate da spore esposte a condizioni ambientali meno favorevoli mostravano una maggiore tolleranza a tali condizioni dopo la germinazione.
Un altro studio, che ha utilizzato EM per valutare specificamente ceppi di C. tyrobutyricum provenienti da formaggi con LBD e altre fonti ambientali, ha mostrato che solo 4 dei 12 ceppi erano in grado di crescere e generare gas durante un’incubazione di 170 giorni a 14°C, e solo uno di questi ceppi ha mostrato questo comportamento in modo coerente in tutte e tre le repliche dell’esperimento.
Gli autori dell’articolo dal quale abbiamo tratto questa sintesi, hanno anche riportato differenze nell’entità della conversione degli acidi organici (ad esempio, da lattico a butirrico), nella quantità di gas generato e nel pH finale raggiunto in EM.
Ad oggi non siamo a conoscenza di studi che abbiano identificato correlazioni tra genotipi di C. tyrobutyricum e la capacità di causare LBD nel formaggio. In questo contesto, l’obiettivo di questo studio era ampliare la comprensione del potenziale di deterioramento dei formaggi da parte di C. tyrobutyricum dipendente dal ceppo, studiando la diversità fenotipica di sei ceppi di C. tyrobutyricum e cercando determinanti genetici associati alla capacità di causare LBD.
Gli obiettivi erano: (1) caratterizzare i ceppi di C. tyrobutyricum in relazione a germinazione, crescita e produzione di gas in formaggi a cagliata lavata e in terreni liquidi, e (2) caratterizzare e confrontare i genomi dei ceppi per identificare eventuali marcatori genetici correlati al fenotipo LBD osservato nei formaggi a cagliata lavata.
Materiali e Metodi
Selezione dei ceppi di C. tyrobutyricum e condizioni di crescita
Sono stati utilizzati sei ceppi di C. tyrobutyricum appartenenti alla collezione microbica del Food Safety Laboratory (FSL) della Cornell University (Ithaca, New York).
- Scelta dei ceppi: basata su origine, localizzazione geografica, caratteristiche fenotipiche e differenze filogenetiche.
- Condizioni di crescita: i ceppi sono stati mantenuti a –80°C e riattivati su terreno RCM (reinforced clostridial medium) in condizioni anaerobiche.
- Preparazione degli inoculi:
Spore: ottenute dopo più subcolture e incubazioni in brodo specifico (TGE), purificate, trattate a 80°C e conservate a 4°C.
Cellule vegetative: ottenute da colture fresche, lavate e standardizzate a circa 10⁷ cfu/mL.
- Esperimenti in terreno liquido:
Condotti in RCM e in EM (enriched milk medium) per testare la crescita, germinazione e produzione di gas a diverse temperature (8°C–37°C) e pH (6.9–4.1).
Inoculi di spore e cellule vegetative sono stati testati separatamente, con tre repliche biologiche per ciascun ceppo.
- Esperimenti su formaggio:
Produzione di formaggi a cagliata lavata (~900 g) con latte pastorizzato, inoculato con ciascun ceppo (spore o cellule vegetative).
Stagionatura di 160–285 giorni a 8°C e 15°C, in metà forma o forma intera.
- Valutazione del difetto (LBD):
Panel di esperti ha valutato visivamente la presenza di gas nel formaggio e nell’imballaggio (punteggio da 0 a 5).
Analisi microbiologiche per contare Clostridium, muffe, lieviti e lattobacilli.
Determinazioni fisico-chimiche: pH, attività dell’acqua e contenuto di acido butirrico (quantificato con GC-MS).
- Analisi genomica:
Sequenziamento dei sei ceppi con Illumina, assemblaggio e annotazione genomica.
Analisi comparative (Roary, ANI, KEGG, COG) per identificare geni accessori e correlazioni con il fenotipo LBD.
Risultati
Esperimenti in terreno liquido indicano che tutti e 6 i ceppi di C. tyrobutyricum sono in grado di crescere a 12,5°C o temperature superiori
Ciascuno dei sei ceppi di Clostridium tyrobutyricum è stato testato per la crescita e la formazione di gas in brodo RCM a quattro diverse temperature.
Quando il brodo è stato inoculato con cellule vegetative, tutti e sei i ceppi hanno mostrato crescita e formazione di gas a 12,5°C o temperature superiori in almeno una delle tre repliche. Solo cinque dei ceppi hanno mostrato la capacità di germinare, crescere e formare gas a 12,5°C o più quando inoculati come spore; tali risultati sono stati coerenti in tutte e tre le repliche biologiche per questi cinque ceppi.
Nessuna delle tre repliche inoculate con spore del ceppo della Cornell E2–8979 ha mostrato crescita a 12,5°C dopo 70 giorni di incubazione, e solo una delle tre repliche inoculate con cellule vegetative di questo ceppo è stata in grado di crescere e formare gas a questa temperatura (attività rilevata dopo 30 giorni di incubazione).
Sebbene la germinazione, la crescita e la formazione di gas a 12,5°C non siano state testate nel terreno EM, tutti e sei i ceppi hanno mostrato crescita e formazione di gas in tale terreno a 37°C e 15°C in almeno due delle tre repliche biologiche.
Nessuno dei sei isolati è stato in grado di crescere in brodo RCM a 8°C (entro 160 giorni) né in brodo EM a 10°C (entro 210 giorni). Quando i tubi sperimentali in RCM incubati a 8°C sono stati trasferiti a 37°C dopo 160 giorni di incubazione, tutti e sei i ceppi hanno mostrato crescita e formazione di gas in almeno una delle tre repliche, indicando che le spore o le cellule vegetative di C. tyrobutyricum possono rimanere vitali per lunghi periodi e che la crescita è almeno parzialmente inibita dalla temperatura di incubazione a 8°C.
Spore o cellule vegetative vitali di C. tyrobutyricum sono risultate presenti anche nel brodo EM dopo 210 giorni di incubazione a 10°C; tuttavia, la semina su agar RCM ha mostrato che le concentrazioni erano ridotte rispetto a quelle iniziali all’inoculo.
Conclusioni
È evidente la necessità di condurre nuovi studi sul difetto di gonfiore tardivo (LBD) e sui microrganismi che lo causano, per ampliare e aggiornare le conoscenze sviluppate ormai diversi decenni fa.
I risultati di questo studio forniscono ulteriori prove che la capacità di causare LBD nei formaggi a cagliata lavata è una caratteristica specifica del ceppo e non un tratto comune a un gruppo di organismi filogeneticamente affini.
Questo suggerisce che le future ricerche dovrebbero concentrarsi sul confronto genotipico e fenotipico tra i ceppi che mostrano, o non mostrano, la capacità di provocare l’LBD nei formaggi, indipendentemente dalle loro differenze filogenetiche.
Tuttavia, questa capacità di causare LBD dovrà probabilmente essere verificata attraverso esperimenti condotti direttamente su formaggi reali, poiché i nostri risultati indicano che la crescita e la formazione di gas osservate nei modelli in terreno liquido non rappresentano sempre accuratamente ciò che accade nel formaggio.
Fonte:”Clostridium tyrobutyricum strains exhibit high genetic diversity and differ in their ability to cause late blowing defect in washed-curd cheese”, Aljoša Trmčić, Lucija Prinčič, Magdalena Pajor,1 Andre P. Kalenak,1 Samuel J. Reichler, Renato H. Orsi, Nicole H. Martin, Martin Wiedmann. Journal of Dairy Science, Volume 108, Issue 11, November 2025, Pages 12026-12045. https://doi.org/10.3168/jds.2025-26686.
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