Latte sicuro in poche ore: un nuovo test molecolare per individuare la presenza di patogeni vitali

Introduzione

Le malattie trasmesse dagli alimenti rappresentano una delle principali sfide per la salute pubblica a livello globale, con milioni di casi ogni anno e numerosi decessi associati al consumo di prodotti contaminati. Tra gli alimenti maggiormente suscettibili vi sono i lattiero-caseari, che grazie al loro elevato contenuto nutrizionale, possono favorire la proliferazione di agenti patogeni lungo tutta la filiera produttiva, dalla produzione al consumo. I principali batteri patogeni presenti nel latte includono Salmonella spp., Escherichia coli produttore di tossina Shiga, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes, responsabili di infezioni gastrointestinali, sindrome uremica emolitica, tossinfezioni e sepsi.

Il rilevamento tempestivo di questi microrganismi è essenziale per garantire la sicurezza alimentare. I metodi tradizionali basati sulla coltura selettiva sono lenti e poco efficaci per cellule non coltivabili, rendendo necessario lo sviluppo di tecniche molecolari rapide, sensibili e specifiche. La PCR multiplex in tempo reale permette di rilevare simultaneamente più geni target attraverso sonde marcate con fluorocromi differenti, garantendo alta precisione e rapidità. Tuttavia, i test convenzionali possono produrre falsi positivi, in quanto non distinguono tra cellule vitali e cellule danneggiate o morte, che contengono comunque DNA amplificabile.

Per migliorare l’accuratezza, i campioni possono essere trattati con SDS e propidio monoazide (PMA). L’SDS aumenta la permeabilità delle cellule non vitali senza danneggiare quelle vive, mentre il PMA si lega al DNA delle cellule danneggiate, impedendone l’amplificazione durante la PCR. Basandosi su questa strategia, è stato sviluppato un test SDS-PMA-mRT-PCR per rilevare simultaneamente e in maniera quantitativa Salmonella spp., E. coli produttore di tossina Shiga, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes nei campioni di latte.

Il metodo ottimizzato ha mostrato un limite di rilevamento di 10² ufc/mL per ciascun patogeno, comparabile alla conta in piastra, ed è risultato efficace anche su campioni di latte contaminati artificialmente. Complessivamente, il test rappresenta uno strumento rapido, sensibile e affidabile per il monitoraggio dei principali batteri patogeni vitali nei prodotti lattiero-caseari, con un potenziale significativo per migliorare la sicurezza alimentare e ridurre i rischi per la salute pubblica.

Materiali e metodi

Ceppi batterici e condizioni di coltura

I ceppi batterici utilizzati nello studio includevano 14 ceppi target (Salmonella spp., E. coli produttore di tossina Shiga, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes) e 19 ceppi non target. Tutti i ceppi sono stati coltivati in terreno Luria-Bertani a 37 °C e 160 rpm per oltre 12 ore. Le sospensioni batteriche sono state preparate partendo da colture a 10⁷ ufc/mL e diluite serialmente in PBS sterile. Per ottenere cellule danneggiate o parzialmente morte, i ceppi target sono stati sottoposti a trattamenti termici controllati, seguiti da raffreddamento su ghiaccio e successiva coltura su piastre per la conta. Il latte utilizzato è risultato privo dei 4 batteri target.

Progettazione di primer e sonde

I primer e le sonde per la mRT-PCR sono stati progettati sulle sequenze dei geni invA, stx1, entFM e mpl, specifici per ciascun batterio target. L’efficacia dei primer è stata verificata tramite test di specificità su 33 ceppi batterici, mentre i prodotti PCR sono stati clonati in vettori, trasformati in cellule competenti e sequenziati per confermare la correttezza delle sequenze.

Estrazione del DNA

Il DNA genomico è stato ottenuto tramite il metodo del bagno di acqua bollente. I campioni batterici sono stati centrifugati, risospesi in tampone TE, trattati in acqua bollente e raffreddati su ghiaccio. Il surnatante contenente DNA è stato raccolto, quantificato con spettrofotometro e conservato a -20 °C fino all’analisi.

Ottimizzazione della mRT-PCR

La PCR monoplex è stata ottimizzata valutando diverse concentrazioni di primer e sonde. Successivamente, è stata condotta una PCR quadruplex con la combinazione ottimale, monitorando i cicli di amplificazione su un sistema real-time. La specificità dei primer e delle sonde è stata verificata su tutti i ceppi target e non target.

Valutazione del limite di rilevamento (LOD)

Il LOD del test SPMP è stato determinato mediante diluizioni seriali dei ceppi target da 10⁷ a 10¹ ufc/mL. Le curve di amplificazione e le curve standard sono state costruite in base ai valori di soglia dei cicli (Ct) e alla concentrazione batterica, calcolando anche l’efficienza di amplificazione per ciascun batterio.

Test di specificità e accuratezza

La specificità del test SPMP è stata valutata su campioni contenenti mix di ceppi target e non target. L’accuratezza è stata confrontata con la mRT-PCR convenzionale e la conta in piastra, utilizzando campioni contenenti cellule vitali e cellule danneggiate dei 4 batteri target.

Analisi statistica

Un campione è considerato positivo se produce una curva sigmoide con Ct ≤ 35. Tutti gli esperimenti sono stati replicati tre volte per valutarne la riproducibilità. I dati sono stati analizzati statisticamente e i grafici elaborati con software dedicati.

Risultati e discussione

Ottimizzazione del test mRT-PCR per il rilevamento dei 4 batteri target

Per garantire la specificità del test mRT-PCR, sono stati selezionati i ceppi rappresentativi di Salmonella spp., E. coli produttore di tossina Shiga, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes. L’amplificazione PCR dei singoli ceppi ha mostrato bande univoche, confermando la specificità dei primer e delle sonde progettati sui frammenti genici amplificati (Figura 1).

Figura 1 – Profili elettroforetici delle amplificazioni PCR per 4 batteri target. M: scala del DNA da 50 bp, 1: Escherichia coli produttore di tossina Shiga (STEC), 2: acqua bidistillata (ddH2O) al posto del modello di DNA da STEC (controllo negativo), 3: Bacillus cereus , 4: ddH2O al posto del modello di DNA da B. cereus (controllo negativo), 5: Listeria monocytogenes , 6: ddH2O al posto del modello di DNA da L. monocytogenes (controllo negativo), 7: Salmonella spp ., 8: ddH2O al posto del modello di DNA da Salmonella spp. (controllo negativo), 9: PCR multiplex per 4 batteri target e 10: ddH2O al posto del modello di DNA da 4 batteri target (controllo negativo).

Le concentrazioni ottimali di primer e sonda sono state determinate tramite RT-PCR monoplex su ciascun batterio, risultando 300 nM per i primer e 200 nM per le sonde. La successiva RT-PCR quadruplex ha mostrato curve di amplificazione con valori Ct compresi tra 14,3 e 20,5 per tutti i geni target (Figura 2), confermando l’efficienza dell’amplificazione simultanea dei 4 batteri.

Figura 2 – Curve di amplificazione della quadrupla PCR real-time per Salmonella spp. (S), Listeria monocytogenes (L), Bacillus cereus (B) ed Escherichia coli produttore di tossina Shiga (STEC), rispettivamente. Le linee orizzontali indicano le soglie di base. RFU = unità di fluorescenza relative.

Ottimizzazione del trattamento SDS-PMA

Per eliminare falsi positivi dovuti a cellule morte o danneggiate, i campioni batterici sono stati trattati con 300 μM di SDS seguiti da PMA a diverse concentrazioni. I risultati hanno indicato che 20 μM di PMA era sufficiente per bloccare l’amplificazione del DNA delle cellule non vitali senza influenzare le cellule vive (Figure 3A–3D). Questo pretrattamento permette di discriminare efficacemente cellule vitali e non vitali durante il test mRT-PCR.

Figura 3 – Ottimizzazione della concentrazione di SDS-propidio monoazide (PMA) per il rilevamento di Listeria monocytogenes (A), Bacillus cereus (B), Salmonella spp. (C) ed Escherichia coli produttore di tossina Shiga (D), rispettivamente. Ogni barra rappresenta il valore Ct medio di 3 test PCR in tempo reale. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (DS) in triplicato.

Curve standard e limite di rilevamento (LOD)

Le reazioni quadruple mRT-PCR su gradienti di concentrazione da 10⁷ a 10¹ ufc/mL hanno mostrato curve a S per concentrazioni da 10⁷ a 10² ufc/mL, mentre non si osservava amplificazione a 10¹ ufc/mL (Figura 4).

Figura 4 – Sensibilità di varie concentrazioni (10⁷ – 10¹ cfu/mL) di ciascun batterio target. Quattro curve di amplificazione di ciascun gradiente di concentrazione ottenute utilizzando la PCR quadrupla in tempo reale da Salmonella spp. (curva gialla), Escherichia coli produttore di tossina Shiga (curva viola), Bacillus cereus (curva verde) e Listeria monocytogenes (curva blu), rispettivamente. RFU = unità di fluorescenza relative.

Il test SPMP ottimizzato ha quindi un LOD di 10² ufc/mL per tutti e 4 i batteri. Le curve standard ottenute da colture pure e campioni di latte contaminato artificialmente (ACM) hanno mostrato elevata linearità e efficienza di amplificazione compresa tra 92,5% e 108,3% (Figure 5A–5D), confermando la sensibilità del metodo anche in presenza di componenti del latte.

Figura 5 – Curve standard per Salmonella spp. (A), Escherichia coli produttore di tossina Shiga (STEC) (B), Bacillus cereus (C) e Listeria monocytogenes (D) nel test SDS-propidium monoazide-multiplex real-time-PCR (SPMP). I modelli di DNA provenivano da una serie di diluizioni batteriche 10 volte superiori. Ogni marcatore di dati rappresenta il valore medio della soglia del ciclo (Ct) di 3 test PCR in tempo reale.

Verifica della specificità del test SPMP

I set di primer e sonde hanno mostrato alta specificità: i segnali positivi sono stati ottenuti solo con i ceppi target, senza cross-reattività con i ceppi non target. La valutazione su campioni di ACM contenenti mix di batteri target e non target ha confermato che la presenza di ceppi non target non influenzava i valori Ct dei batteri target (Figura 6).

Figura 6 – Valore soglia del ciclo (Ct) della PCR real-time multiplex SDS-propidio monoazide per 4 batteri target o 4 batteri target e 19 ceppi non target in campioni di latte, rispettivamente. Ogni barra rappresenta il valore Ct medio dell’analisi quadrupla. Le barre di errore rappresentano la DS in triplicato. Bacillus cereus ; Listeria monocytogenes ; Escherichia coli produttore di tossina Shiga ; Salmonella spp.

Valutazione comparativa tra SPMP, mRT-PCR e conta in piastra

Il test SPMP è stato confrontato con la mRT-PCR convenzionale e la conta in piastra su campioni di latte contaminato artificialmente. I valori Ct ottenuti dal test SPMP erano simili ai risultati della conta in piastra, mentre la mRT-PCR convenzionale tendeva a sovrastimare i valori a causa dell’amplificazione del DNA di cellule morte o danneggiate (Figura 7). Questi risultati confermano che il test SPMP permette di rilevare simultaneamente e con precisione le cellule vitali di Salmonella spp., E. coli produttore di tossina Shiga, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes nei campioni di latte.

Figura 7 – Enumerazione di Listeria monocytogenes , Bacillus cereus , Salmonella spp. vitali ed Escherichia coli produttori di tossina Shiga mediante PCR real-time multiplex (punti), PCR real-time multiplex SDS-propidio monoazide (quadrati) e conteggi su piastra (linee diagonali) in campioni di latte contaminato artificialmente (ACM). Le barre di errore indicano la deviazione standard in triplicato.

Conclusioni

E’ stato messo a punto un metodo SPMP, in cui la mRT-PCR è stata condotta in combinazione con il pretrattamento SDS/PMA, per rilevare in modo accurato e simultaneo SS, STEC, BC e LM vitali in campioni di latte utilizzando set di primer e sonde specifici. Questo test è stato in grado di rilevare selettivamente cellule batteriche vitali senza alcuna interferenza da parte di cellule batteriche morte o danneggiate.

Il test ha mostrato un LOD di 10 ² ufc/mL per ciascun batterio target. I risultati indicano che il test SPMP sviluppato può potenzialmente essere utilizzato per rilevare quantitativamente e simultaneamente SS, STEC, BC e LM in campioni di latte entro 7 ore dall’estrazione del DNA dai campioni per ottenere i risultati della mRT-PCR.

Fonte: “Simultaneous quantitative detection of viable Salmonella spp., Shiga toxin–producing Escherichia coli, Bacillus cereus, and Listeria monocytogenes in milk through multiplex real-time polymerase chain reaction”, P. Liu, C. Shi, Y. Wang, H. Gao, S. Wang, and P. Ai. J. Dairy Sci. 108:6803–6813. https://doi.org/10.3168/jds.2025-26278

Autore: Elisabetta Simonetti