I microrganismi del kefir si sono evoluti con l’uomo. Lo dimostra l’analisi di nuovi campioni dell’età del bronzo

Introduzione

Il consumo di alimenti fermentati è una delle pratiche più antiche dell’umanità e influenza profondamente il microbiota intestinale attraverso l’introduzione di microrganismi benefici. Il numero di microrganismi presenti negli alimenti fermentati è decisamente superiore rispetto a quelli negli alimenti freschi, contribuendo all’arricchimento di batteri probiotici, come i lattobacilli, che offrono benefici per la salute intestinale e immunitaria.

L’inizio della fermentazione del latte risale almeno al 6000-4000 a.C. in India e al 7000 a.C. nel Mediterraneo, ma la storia dettagliata della trasformazione dei latticini fermentati e l’evoluzione dei loro microrganismi rimane poco chiara, principalmente a causa della scarsità di reperti archeologici ben conservati.

Per approfondire queste conoscenze, è stato analizzato il DNA di tre resti di kefir di circa 3.500 anni fa rinvenuti nel cimitero di Xiaohe, nello Xinjiang (Cina). La presenza di proteine del latte di ruminanti, batteri dell’acido lattico e lieviti ha confermato che questi campioni erano in effetti kefir prodotto dalla popolazione Xiaohe dell’età del bronzo, che praticava un’economia mista fatta di agricoltura, produzione casearia e caccia. Sebbene gli individui Xiaohe mostrassero una limitata interazione genetica con altre popolazioni, i dati mitocondriali indicano connessioni materne con gruppi eurasiatici orientali e occidentali.

L’analisi di questi reperti ha permesso di esplorare non solo l’uso dei latticini fermentati da parte della popolazione Xiaohe, ma anche la coevoluzione tra i batteri fermentativi e gli esseri umani. Grazie alle informazioni fornite dal DNA antico, è possibile ricostruire dettagli inediti sulla diffusione delle tecniche casearie e sull’impatto delle attività umane nell’evoluzione del microbiota fermentativo, offrendo così nuove prospettive sulla storia culturale e alimentare dell’umanità.

Risultati

L’inizio della storia dei latticini fermentati risale all’antichità, ma le prove materiali e molecolari sono scarse. Tuttavia, in molte popolazioni, i latticini fermentati hanno avuto un ruolo culturale importante e sono stati mantenuti nel tempo. I pastori neolitici hanno contribuito alla diffusione dell’allevamento e della produzione di latticini nella steppa eurasiatica. Poco si sa, però, sull’origine e la diffusione di queste tecniche nell’Asia orientale.

Grazie all’analisi di campioni di derivati del latte dell’età del bronzo provenienti dal cimitero di Xiaohe (Xinjiang, Cina), è stato possibile studiare il DNA di una specie di Lactobacillus consumata per millenni. Tre campioni (3600–3400 BP) sono stati recuperati dalle tombe M25, M28 e M29 (Figure 1A–1C). Questi campioni erano posizionati attorno al collo delle mummie (Figura 1B).

Figura 1 – (A) La posizione e la disposizione del cimitero di Xiaohe, dove si trova il kefir più antico fino ad oggi. Le tombe da cui sono stati raccolti i campioni di kefir utilizzati in questo studio sono etichettate in rosso. (B) Una foto di una delle mummie del cimitero di Xiaohe, con i campioni di kefir (evidenziati con triangoli rossi) sparsi attorno al collo della mummia. (C) I tre campioni di kefir. (D) I profili metagenomici dei campioni di kefir a livello di dominio (in alto) e di phylum (in basso).

Per identificare gli animali da latte allevati a Xiaohe e le interazioni con le popolazioni della steppa, è stata effettuata un’analisi del DNA mitocondriale dei mammiferi per risalire alle specie che hanno prodotto il latte usato per il kefir. Inoltre, il sequenziamento shotgun ha permesso di ricostruire le informazioni metagenomiche del campione e di tracciare l’evoluzione del suo microbioma nel tempo.

Un’analisi specifica è stata condotta sul Lactobacillus kefiranofaciens, un batterio chiave nella fermentazione del kefir. Grazie all’uso di 700.000 sonde per il DNA, è stato possibile arricchire il DNA del batterio dal <1% al 64-80% del DNA totale, consentendo un’analisi completa del suo genoma antico.

Il DNA di capra suggerisce associazioni tra Xiaohe e la popolazione della steppa

Per determinare il tipo di bestiame utilizzato nella produzione dei latticini e la relazione filogenetica con altri animali domestici, è stato analizzato il DNA dei ruminanti nei campioni di kefir. Il DNA mitocondriale di Bos o Capra è stato rilevato in tutti e tre i campioni.

La presenza di Bos e Capra potrebbe essere correlata ai resti scheletrici rinvenuti nel sito di Xiaohe. Tuttavia, non è stata osservata la coesistenza dei due DNA nello stesso campione, suggerendo che il kefir dell’età del bronzo nello Xinjiang fosse prodotto separatamente con latte bovino o caprino, a differenza dei formaggi misti della tradizione greco-mediorientale (Figura 2A).

La trasformazione riduce significativamente il contenuto di lattosio, il che potrebbe aver reso il consumo di latticini più accessibile alle popolazioni Xiaohe, geneticamente intolleranti al lattosio. Questo processo avrebbe quindi contribuito sia alla conservazione del latte che alla riduzione dei disturbi gastrointestinali.

Per esplorare la connessione tra le capre europee e quelle usate nella produzione di kefir nel bacino del Tarim durante l’età del bronzo, è stata ottenuta una bozza del genoma mitocondriale  mappando i dati sul genoma di Capra hircus di riferimento. È stato costruito un albero filogenetico (RAxML) con 185 genomi mitocondriali di capre antiche e moderne distribuite in Eurasia (Figure 2A).

Il DNA mitocondriale della capra di Xiaohe (M28) rientra nel clade A, raggruppandosi con campioni neolitici, calcolitici e dell’età del bronzo provenienti dall’Europa e dall’Asia centrale. L’aplogruppo A si è diffuso in Europa dopo il Neolitico, probabilmente a seguito degli spostamenti delle popolazioni della steppa, che hanno svolto un ruolo chiave nelle interazioni umane e nella diffusione della domesticazione animale. Inoltre, il campione Xiaohe-M28 si distingue dalle capre dell’Asia orientale dell’età del bronzo, indicando una storia di domesticazione separata.

Figura 2 – (A) La filogenesi dei genomi mitocondriali di capra costruiti da capre eurasiatiche antiche e moderne. L’età e le posizioni di campionamento delle capre sono indicate da forme e colori diversi: antica, cerchio; moderna, triangolo; Eurasia (Asia orientale esclusa), blu; Asia orientale, arancione. La capra Xiaohe-M28 è indicata da un cerchio rosa. I rami collassati sono ispessiti. (B) La presenza di specie batteriche nei campioni di kefir dell’età del bronzo. (C) L’abbondanza di specie fungine. L’abbondanza di ogni specie è indicata dalla tonalità di verde e la presunta fonte delle specie batteriche è indicata dalla barra colorata sul lato destro (blu, specie identificate nei grani di kefir; giallo, specie identificate nel latte fermentato; marrone, specie identificate nella contaminazione da latticini; henné, specie identificate da alimenti fermentati; verde, fonti sconosciute, probabilmente da una fonte ambientale).

Ricostruzione della comunità microbica dell’antico kefir

L’analisi metagenomica dei resti di kefir dell’età del bronzo ha permesso di studiare l’evoluzione dei microrganismi nel latte fermentato nel corso di migliaia di anni. La maggior parte delle sequenze dei tre campioni appartengono a batteri ed eucarioti, sebbene con proporzioni variabili (Figure 1D).

A livello di specie, nei campioni sono state identificate rispettivamente 2, 4 e 31 specie batteriche (Figure 2B, 2C).

In Xiaohe-M25 sono presenti solo Lactobacillus kefiranofaciens e Lactobacillus helveticus, tipici dei grani di kefir moderni, suggerendo una scarsa contaminazione ambientale. In Xiaohe-M28 sono state identificate due specie di Bacillus, Staphylococcus cohnii e Halomonas massiliensis, comuni nell’ambiente e nella flora umana. In Xiaohe-M29, la maggior parte dei batteri proviene dall’ambiente, tra cui Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus e Oceanobacillus, con una presenza minore di L. kefiranofaciens.

Oltre ai batteri, sono state trovate diverse specie fungine in Xiaohe-M25, con un totale di 41 specie di Saccharomyces e la presenza di Pichia kudriavzevii e Kluyveromyces marxianus, comuni nei grani di kefir moderni. Sono state inoltre identificate 23 specie di Aspergillus e 4 di Penicillium (Figure 2B, 2C). In Xiaohe-M28 sono stati rilevati Aspergillus e Penicillium, ma non i tipici funghi del kefir, mentre in Xiaohe-M29 sono presenti solo Aspergillus glaucus e Aspergillus pseudoglaucus, comuni nei prodotti fermentati deteriorati.

Si osserva una correlazione negativa tra il numero di specie batteriche e fungine (r = −0,89), sebbene non statisticamente significativa (p = 0,30), suggerendo una competizione tra batteri e funghi. Inoltre, alcuni Aspergillus possiedono attività antibatterica e Penicillium rubens, produttore di penicillina, è abbondante in Xiaohe-M25. Quest’ultimo presenta anche la maggiore diversità di batteri ambientali e una bassa abbondanza di Aspergillus, evidenziando il ruolo delle dinamiche microbiche nella conservazione dei metagenomi antichi.

La filogenesi dei genomi di L. kefiranofaciens fa luce sulla diffusione del kefir

Gli scienziati hanno analizzato il DNA presente nei resti di formaggio kefir dell’età del bronzo per capire come i microrganismi del latte fermentato siano cambiati nel tempo. Hanno scoperto che la quantità e il tipo di batteri e altri microrganismi variano tra i campioni. Ad esempio, Xiaohe-M25 ha mostrato una maggiore quantità di DNA rispetto agli altri campioni, probabilmente a causa delle condizioni di conservazione (Figura 3A).

Nel campione Xiaohe-M25 sono stati trovati batteri tipici del kefir moderno, come Lactobacillus kefiranofaciens e Lactobacillus helveticus, suggerendo una scarsa contaminazione esterna. Al contrario, Xiaohe-M28 e Xiaohe-M29 contenevano molti più batteri ambientali e meno quelli specifici del kefir. Anche la presenza fungina variava: Xiaohe-M25 conteneva specie comuni nei grani di kefir odierni, mentre gli altri campioni mostravano più funghi legati al deterioramento dei cibi. Questo indica che il microbioma del kefir antico poteva cambiare nel tempo e in base alle condizioni di conservazione (Figura 3A).

Per approfondire le origini del kefir, i ricercatori hanno ricostruito il genoma del batterio L. kefiranofaciens, fondamentale per la fermentazione. Utilizzando una tecnica di arricchimento del DNA, sono riusciti a ottenere informazioni dettagliate sui ceppi antichi, ricostruendo genomi con un’elevata accuratezza (Figura 3A). L’analisi filogenetica ha mostrato che il ceppo Xiaohe-M25 ha una forte parentela con i ceppi moderni di L. kefiranofaciens, confermando la continuità di questo batterio nella produzione di kefir nel tempo (Figura 3B).

Figure 3 – (A) I genomi ricostruiti di L. kefiranofaciens. Dall’interno verso l’esterno: skew guanina-citosina (GC) (grigio chiaro < 0, rosa chiaro > 0) del genoma di riferimento L. kefiranofaciens ZW, contenuto di GC del genoma di riferimento L. kefiranofaciens ZW, copertura e profondità dell’antico ceppo di L. kefiranofaciens Xiaohe-M28 (blu), del ceppo di L. kefiranofaciens Xiaohe-M29 (rosso) e del ceppo di L. kefiranofaciens Xiaohe-M25 (verde). (B) La filogenesi dei ceppi di L. kefiranofaciens. I valori di supporto sono mostrati sui rami, gli antichi ceppi Xiaohe sono evidenziati in rosso e le posizioni di campionamento dei ceppi sono incluse tra parentesi.

Adattamento continuo nei ceppi di L. kefiranofaciens

Gli scienziati hanno studiato il batterio Lactobacillus kefiranofaciens per capire come si sia adattato nel tempo alla fermentazione del kefir. Hanno analizzato i suoi geni e scoperto che il suo pan-genoma è ancora “aperto”, il che significa che può integrare nuovo DNA dall’ambiente (Figura 4A). Questo gli permette di evolversi continuamente.

Confrontando i geni di 16 ceppi, sia antichi che moderni, gli autori hanno trovato che oltre il 63% di essi è condiviso tra tutti. I batteri più recenti mostrano variazioni nei geni legati al metabolismo e alla struttura cellulare, mentre il ceppo antico Xiaohe-M25 ha perso alcuni geni, probabilmente a causa della degradazione del DNA nel tempo (Figura 4B).

L’analisi del trasferimento genico orizzontale (HGT) ha mostrato che i ceppi moderni hanno acquisito nuove sequenze genetiche, assenti nel ceppo antico. Ad esempio, nel batterio moderno L. kefiranofaciens ZW3, sono state identificate cinque regioni di DNA che contengono geni utili per la regolazione e la difesa cellulare, probabilmente ottenute da altri microrganismi (Figura 4C). Questi adattamenti hanno reso i ceppi attuali più resistenti e funzionali rispetto a quelli antichi.

Figure 4 – (A) I profili funzionali dei ceppi antichi e attuali di L. kefiranofaciens. I gruppi funzionali sono contrassegnati da colori diversi. Nonostante la leggera varianza nella proporzione di geni di diversi gruppi funzionali, i genomi antichi e attuali di L. kefiranofaciens mostrano profili funzionali simili. (B) La presenza (verde) e l’assenza (grigio) di geni dei principali gruppi funzionali dei ceppi antichi e attuali di L. kefiranofaciens . Si noti che sono mostrati solo i geni non ubiquitariamente presenti in tutti i ceppi e i geni mancanti nel ceppo antico non riflettono necessariamente l’assenza del gene. (C) Le regioni di trasferimento genico orizzontale putative sono state identificate tramite il confronto dell’antico genoma di L. kefiranofaciens con l’attuale L. kefiranofaciens ZW3. Triangoli arancioni, elementi mobili; pentagoni blu, geni funzionali; pentagoni grigi, geni putative. Le direzioni dei geni e degli elementi mobili sono indicate dall’orientamento delle forme.

Conclusioni

Lo studio fornisce prove molecolari dell’uso del kefir nell’età del bronzo, rivelando le interazioni culturali della popolazione Xiaohe con altre comunità eurasiatiche. L’analisi filogenetica mostra due distinte rotte di diffusione di L. kefiranofaciens: kefiranofaciens diffuso dall’Xinjiang al Tibet e kefirgranum dall’area caucasica verso l’Europa.

L’evoluzione del microbiota del kefir evidenzia l’influenza umana sulla diversificazione di L. kefiranofaciens, con eventi di trasferimento genico orizzontale (HGT) che hanno favorito l’adattamento a stress ambientali, difese batteriche e interazioni con l’ospite umano. Tuttavia, è stata osservata anche la trasmissione di geni di resistenza agli antibiotici.

Infine, l’analisi della conservazione del DNA microbico nel kefir antico mostra una comunità microbica stabile, resistente alla contaminazione, suggerendo un’antica consapevolezza nella gestione della fermentazione.

Fonte: “Bronze Age cheese reveals human-Lactobacillus interactions over evolutionary history”, Yichen Liu, Bo Miao, Wenying Li, Chan Tian, Yimin Yang, Qiaomei Fu. Cell Volume 187, Issue 21, p5891-5900.e8October 17, 2024. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.08.008