La centrifugazione a freddo ad alta velocità del latte crudo modifica microbiota, maturazione e caratteristiche sensoriali dei formaggi duri

Introduzione

Il Grana Padano (GP) è un formaggio a pasta dura DOP ottenuto da latte crudo parzialmente scremato e addizionato di sieroinnesto naturale. La sua complessa comunità microbica deriva dall’equilibrio tra i batteri lattici autoctoni del latte crudo (NSLAB) e quelli presenti nel sieroinnesto (SLAB). Durante il processo di caseificazione e maturazione, queste popolazioni subiscono una selezione naturale che influisce sulle caratteristiche biochimiche e sensoriali del formaggio.

Uno degli aspetti critici nella produzione del GP è la possibile presenza di spore di Clostridium sporigeni, responsabili del gonfiore tardivo, un difetto che compromette la qualità del prodotto. Per limitare questo problema, l’industria casearia utilizza spesso la centrifugazione ad alta velocità (bactofugazione) per rimuovere le spore dal latte. Tuttavia, tale processo, che opera tipicamente tra 50 e 60 °C, non è compatibile con la produzione di formaggi a latte crudo, in quanto il regolamento europeo impone che il latte crudo non venga riscaldato oltre i 40 °C.

Recenti studi hanno indagato l’efficacia della centrifugazione a bassa temperatura (39 °C) per la produzione di formaggi duri a latte crudo. È stato dimostrato che questa tecnica rimuove fino al 98,2% delle spore con doppia centrifugazione, riducendo al contempo la conta batterica e le cellule somatiche. Tuttavia, ha anche effetti negativi: la resa casearia diminuisce del 2,5-3,5% e si verifica una significativa alterazione della comunità microbica. Nello specifico, il latte centrifugato presenta una concentrazione inferiore di LAB, una ridotta presenza di batteri bastoncellari e una velocità di acidificazione più rapida.

Questi cambiamenti sono particolarmente rilevanti per il GP, in cui i batteri mesofili del genere Lacticaseibacillus (ex Lactobacillus) giocano un ruolo chiave nella proteolisi e nella formazione del profilo aromatico. La rimozione preferenziale di NSLAB altera il processo di maturazione e la composizione finale del formaggio.

L’obiettivo del presente studio è quindi valutare l’impatto della centrifugazione a 39 °C sul processo di maturazione del GP. Per farlo, sia i formaggi ottenuti da latte centrifugato sia quelli di controllo sono stati analizzati fino a 20 mesi di stagionatura. Le analisi hanno riguardato il conteggio dei LAB, la composizione chimica, la proteolisi, i composti volatili e le caratteristiche sensoriali, al fine di comprendere le reali conseguenze di questa tecnica sulla qualità del prodotto finale.

Materiali e metodi

Progettazione dello studio, produzione del formaggio e campionamento
I formaggi trattati (E) e di controllo (C) sono stati prodotti in un caseificio del Grana Padano (GP) utilizzando latte crudo di tre aziende locali. Il latte scremato è stato diviso in due flussi: il controllo (C) con aggiunta di lisozima e i formaggi trattati (1E e 2E) senza lisozima, ottenuti tramite una o due fasi di centrifugazione. Dopo la centrifugazione e degasaggio, il latte è stato lavorato in 40 vasche. Sono stati prodotti 11.200 formaggi, stagionati fino a 20 mesi. Il campionamento è avvenuto a 9, 15 e 20 mesi su 320 formaggi. Un’ulteriore produzione ha valutato l’effetto del lisozima. Le forme sono state analizzate con raggi X per difetti. Il campionamento includeva porzioni per analisi chimiche, sensoriali e microbiologiche.

Fig. 1. Disegno sperimentale che mostra la produzione di formaggi sperimentali (E) e di controllo (C) durante la configurazione singola (1E) e doppia (2E) e nella caseificazione aggiuntiva . Sono stati prodotti controlli appropriati all’interno di ciascuna configurazione.

Batteri dell’acido lattico nel formaggio
Dieci grammi di formaggio grattugiato sono stati sospesi in soluzione di citrato trisodico e omogeneizzati. Dopo diluizioni seriali, i campioni sono stati incubati su agar MRS per quantificare i lattobacilli mesofili. Sono stati analizzati 252 formaggi. Il DNA batterico è stato estratto tramite omogeneizzazione e purificazione automatizzata, quantificato con fluorimetria. La RT-qPCR ha quantificato specifiche specie di Lacticaseibacillus e Limosilactobacillus fermentum utilizzando primer specifici.

Analisi della composizione del formaggio
L’umidità, le proteine, i grassi e le ceneri sono stati determinati seguendo standard ISO. L’umidità nella sostanza non grassa (MNFS) è stata calcolata. La maturazione è stata valutata tramite elettroforesi capillare a zona (CZE), separando frazioni specifiche di caseina. Sono stati calcolati rapporti di aree di picco normalizzate per tracciare la degradazione. L’accumulo di aminoacidi liberi è stato quantificato mediante cromatografia a scambio ionico con calibrazione multipunto. L’analisi dei composti volatili è stata effettuata con microestrazione in fase solida e gascromatografia-spettrometria di massa (SPME GC–MS). Il formaggio grattugiato è stato equilibrato a 45 °C prima dell’analisi. Sono stati identificati e quantificati i composti volatili usando la libreria NIST.

Analisi sensoriale del formaggio
Un panel di 10 esperti ha valutato i formaggi E e C a 9, 15 e 20 mesi utilizzando un profilo descrittivo con 14 attributi sensoriali. Le valutazioni sono state eseguite seguendo gli standard ISO, con un punteggio da 0 a 7. Quattro campioni sono stati testati per sessione, con analisi statistica tramite HSD di Tukey.

Risultati e discussione

Composizione del formaggio e popolazione microbica
La composizione chimica dei formaggi trattati (1E, 2E) e di controllo (C) è stata valutata in diverse fasi di maturazione. L’umidità è diminuita con il tempo, e dopo 9 mesi il contenuto di grassi nei formaggi E era significativamente inferiore.

Fig. 2. Conteggio su piastra di lattobacilli vitali in agar MRS nel pannello i) e quantificazione di Lacticaseibacillus e Limosilactobacillus fermentum nei pannelli ii) e iii), in formaggi a diversi tempi di maturazione. Le differenze statistiche tra formaggi di controllo (C) e sperimentali (E) tra entrambe le configurazioni (1E e 2E) a ciascun tempo di maturazione sono indicate da lettere diverse (ANOVA; p < 0,05).

La conta dei lattobacilli vitali ha mostrato una riduzione progressiva durante la maturazione, con valori significativamente inferiori nei formaggi E rispetto ai C (Fig. 2-i). Dopo 20 mesi, la riduzione dei LAB vitali ha raggiunto il 6,4% nei formaggi 1E e il 3,4% nei 2E rispetto ai C. Analogamente, il genere Lacticaseibacillus, fondamentale per lo sviluppo dell’aroma, è risultato ridotto del 73% in 1E e del 54% in 2E (Fig. 2-ii). Tuttavia, Limosilactobacillus fermentum, responsabile di difetti come la formazione di microfori, era presente in concentrazioni inferiori rispetto a Lacticaseibacillus e la sua variazione nei formaggi E risultava meno regolare (Fig. 2-iii).

Proteolisi e metabolismo degli aminoacidi
La proteolisi primaria è stata analizzata tramite elettroforesi capillare di zona, evidenziando una degradazione progressiva delle caseine αs1 e β durante la maturazione, senza differenze significative tra formaggi C ed E. La plasmina è rimasta attiva, senza effetti della centrifugazione.

La proteolisi secondaria è stata valutata tramite il contenuto di aminoacidi liberi (FAA), che ha mostrato lievi aumenti tra 9 e 20 mesi. Tuttavia, differenze significative sono emerse nel contenuto di singoli FAA: la serina (Ser) era inferiore nei formaggi E, mentre l’alanina (Ala) risultava più elevata. Inoltre, nei formaggi E si è osservata una minore conversione dell’arginina (Arg) in citrullina (Cit) e ornitina (Orn), suggerendo un diverso utilizzo del percorso ADI da parte dei batteri residui (Fig. 3A).

Fig. 3. A ) Contenuto relativo di arginina (Arg), citrullina (Cit) e ornitina (Orn) in formaggi sperimentali prodotti con centrifugazione singola (1E) o doppia (2E) del latte in parallelo con i corrispondenti formaggi di controllo (C) a diversi tempi di maturazione. B) Contenuto relativo di Arg, Cit e Orn nei formaggi C e 1E prodotti con (1E + LYZ) e senza (1E) l’aggiunta di lisozima e in parallelo con un formaggio di controllo.

L’assenza di lisozima nei formaggi E potrebbe aver contribuito a questa variazione, ma esperimenti paralleli con e senza lisozima hanno confermato che la centrifugazione del latte era il principale fattore responsabile delle differenze nel metabolismo dell’arginina (Fig. 3B).

Composti volatili nei formaggi stagionati 20 mesi
L’analisi dei composti volatili (COV) nei formaggi E e C, condotta tramite SPME-GC, ha evidenziato una presenza inferiore di esteri etilici nei campioni E rispetto ai campioni C. In particolare, il butanoato di etile ed l’esanoato di etile, responsabili delle note fruttate e caseose, erano meno abbondanti nei formaggi E. La ridotta concentrazione di COV nei campioni E è stata attribuita alla minore presenza di cellule microbiche vitali, a seguito della centrifugazione del latte, confermando il ruolo delle specie NSLAB nella formazione dell’aroma.

Profilo sensoriale descrittivo
L’analisi sensoriale dei formaggi a 9, 15 e 20 mesi (Fig. 4) ha mostrato che i campioni E avevano punteggi inferiori per consistenza, struttura granulare e friabilità rispetto ai campioni C, suggerendo una perdita parziale delle caratteristiche strutturali tipiche dei formaggi a pasta dura. Il colore dei campioni E risultava più intenso, mentre i sapori tipici (odore, sapidità, piccantezza) erano meno percepiti, in linea con i risultati dei COV. Tuttavia, i tratti legati ai difetti del sapore (amaro, sapore acido, astringenza) non sono stati influenzati dal trattamento. Il test HSD di Tukey (Tabella 4) ha evidenziato differenze significative per 5-8 tratti sensoriali tra i formaggi, con il colore come caratteristica distintiva in tutte le condizioni analizzate.

Fig. 4. Profili sensoriali definiti da un panel test per formaggi sperimentali (rossi) e di controllo (verdi) a diversi tempi di maturazione. I formaggi sperimentali sono stati prodotti con centrifugazione singola (linea continua) o doppia (linea tratteggiata) del latte in parallelo con i corrispondenti formaggi di controllo.

Analisi delle componenti principali
L’analisi delle componenti principali (PCA, Fig. 5) ha identificato sei variabili principali (Arg, Cit, Orn, Gln, Ser e conteggi di lattobacilli vitali), con un contributo totale dell’81,8% alla variabilità del dataset. I formaggi E (cerchi vuoti) si sono raggruppati prevalentemente nella parte negativa del primo componente, mentre i formaggi C (cerchi pieni) erano nella parte positiva. Il secondo componente ha evidenziato una distribuzione progressiva in funzione del tempo di maturazione. Il grafico dei caricamenti (Fig. 5B) ha mostrato che Cit, Orn e Arg erano determinanti nella separazione tra E e C, mentre Ser, Gln e i lattobacilli vitali descrivevano la progressione della proteolisi nel tempo.

Fig. 5. Analisi delle componenti principali di formaggi sperimentali (cerchi vuoti) e di controllo (cerchi pieni) stagionati per 9, 15 e 20 mesi. Il pannello A si riferisce al grafico dei punteggi e il pannello B si riferisce ai carichi di singole variabili: Arg = arginina, Gln = glutammina, Cit = citrullina, Orn = ornitina, Ser = serina e lattobacilli vitali .

Conclusioni

Sebbene condotta a una temperatura non usuale (39 °C), la centrifugazione ad alta velocità del latte (o bactofugazione) testata in questo studio ha causato una selezione del microbiota del latte che senza dubbio si è riflessa su quella del formaggio.

La concentrazione di lattobacilli vitali è stata inferiore nei formaggi sottoposti al trattamento (E) durante l’intero periodo di maturazione, ma anche le specie con una minore propensione ad adottare il percorso ADI o a metabolizzare aminoacidi liberi (FAA) in composti volatili (COV) sono state selettivamente trattenute.

Più in generale, gli autori hanno concluso che la rimozione delle specie autoctone di batteri lattici autoctoni del latte crudo (NSLAB) potrebbe essere potenzialmente negativa per qualsiasi tipo di formaggio a latte crudo, perché influenza i percorsi microbici che operano nella maturazione del formaggio.

In questo contesto, le restrizioni fornite dalle specifiche dei formaggi DOP a latte crudo mirano a preservare le caratteristiche uniche di tali formaggi. I pretrattamenti del latte crudo che modificano anche parzialmente il suo microbiota nativo possono influenzare il successivo processo di maturazione del formaggio in vari modi.

In conclusione, la centrifugazione ad alta velocità del latte ha alterato il tipico modello FAA e vari attributi sensoriali del formaggio Grana Padano, compromettendo così le caratteristiche uniche molto apprezzate dai consumatori di tutto il mondo.

Fonte: “High-speed cold centrifugation of milk modifies the microbiota, the ripening process and the sensory characteristics of raw-milk hard cheeses”, Paolo D’Incecco, Luca Bettera, Elena Bancalari, Veronica Rosi, Marta Sindaco, Serena Gobbi, Paolo Candotti, Nelson Nazzicari, Sara Limbo, Monica Gatti, Luisa Pellegrino. Food Research International Volume 172, October 2023, 113102. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2023.113102