Listeria monocytogenes nei formaggi: una nuova tecnica per sconfiggerla

Introduzione

I composti antimicrobici prodotti da microrganismi di grado alimentare, come le batteriocine sintetizzate dai batteri lattici (LAB), rappresentano una strategia naturale per controllare i patogeni di origine alimentare, rispondendo alla crescente domanda di alimenti sicuri e privi di conservanti chimici. Le batteriocine, tra cui le enterocine prodotte dal genere Enterococcus, sono peptidi in grado di inibire la crescita microbica attraverso l’interazione con la membrana cellulare, inibendo la sintesi del peptidoglicano o formando pori nella membrana. Listeria monocytogenes è un patogeno difficile da controllare nella produzione del formaggio, poiché sopravvive a basse temperature, pH acido e alte concentrazioni di sale. L’uso di film edibili a base di biopolimeri come la gelatina, con l’incorporazione di batteriocine, ha dimostrato di prevenire la crescita di L. monocytogenes grazie al rilascio graduale di composti ad attività antimicrobica. Inoltre, l’impiego del siero di latte come substrato per la produzione di batteriocine e per la creazione di film rappresenta un’opzione sostenibile per ridurre i rifiuti industriali e garantire la sicurezza alimentare. Nella pubblicazione su Food Microbiology del febbraio 2023 vengono illustrati i risultati ottenuti con questa tecnica innovativa.

Materiali e metodi

Enterococcus faecalis L2B21K3 e L3A21K6, che erano stati precedentemente isolati e caratterizzati, sono stati utilizzati come produttori di batteriocina, mentre Listeria monocytogenes ATCC 7644 è stato impiegato come ceppo indicatore per l’attività antimicrobica. Le colture di E. faecalis sono state attivate in brodo MRS (Biokar Diagnostics, Francia) e incubate a 30 °C per 18 ore. Le colture stock sono poi state conservate a -20 °C in brodo MRS e Nutrient con l’aggiunta di glicerolo al 30%.

Per quanto riguarda la coltura dei batteri, E. faecalis L2B21K3 e L3A21K6 sono stati inoculati separatamente in brodo MRS a una concentrazione di 10^8 CFU/mL e incubati a 30 °C per 24 ore. Le cellule sono state successivamente raccolte e trasferite in siero dolce per monitorare la crescita e l’attività della batteriocina, che è stata determinata mediante il test spot-on-the-lawn.

Per produrre la soluzione di siero di enterocina (EWS), i ceppi E. faecalis L2B21K3 e L3A21K6 sono stati trasferiti in siero dolce e incubati per 48 ore. Dopo la centrifugazione, i surnatanti sono stati denominati EWS L2 e EWS K6. L’attività antimicrobica di questi surnatanti è stata poi valutata con il test spot-on-the-lawn.

Per la preparazione dei film bioattivi, sono stati sciolti 6 g di gelatina e 2 g di glicerolo in 100 mL di siero dolce o EWS. Sono stati preparati tre set di film: SW (controllo), EWS L2 e EWS K6. L’attività antimicrobica dei film liquidi è stata testata prima dell’essiccazione utilizzando il test spot-on-the-lawn.

I film bioattivi sono stati testati contro L. monocytogenes per valutarne l’efficacia antimicrobica. In un’analisi qualitativa, campioni di film EWS L2 e EWS K6 (20 × 20 mm) sono stati posizionati su agar PCA con L. monocytogenes, e la presenza di aloni di inibizione è stata misurata. Inoltre, un’analisi quantitativa è stata condotta per 30 giorni, durante i quali la vitalità del batterio è stata periodicamente valutata. La diffusione delle batteriocine dai film è stata esaminata immergendo i film EWS in una soluzione di glicerolo al 60% per 30 giorni, con il test spot-on-the-lawn utilizzato per misurare l’attività dell’enterocina.

Per verificare l’efficacia antimicrobica dei film nei formaggi, i campioni di formaggio sono stati rivestiti con le pellicole bioattive (SW, EWS L2, EWS K6) e inoculati con L. monocytogenes. La vitalità del batterio è stata poi valutata dopo la rimozione del film. La figura 1 mostra il confronto tra l’aspetto di campioni di formaggio con pellicola bioattiva e formaggio non trattato dopo 30 giorni.

Fig. 1. Confronto dell’aspetto dei campioni di formaggio con pellicola bioattiva (A) e formaggio scoperto (B) dopo 30 giorni.

Per quanto riguarda la caratterizzazione fisico-chimica dei film, sono stati effettuati diversi test. Lo spessore delle pellicole è stato misurato con un calibro digitale. L’umidità e la solubilità dei film sono state determinate pesando i campioni prima e dopo l’essiccazione. Le proprietà di trazione del film, come la resistenza alla trazione e l’allungamento a rottura, sono state valutate utilizzando un analizzatore di texture. Infine, la permeabilità al vapore acqueo è stata misurata tramite un metodo gravimetrico per determinare la velocità di trasmissione e la permeabilità del vapore.

Risultati e discussione

La crescita e la produzione di batteriocina da parte dei ceppi Enterococcus faecalis L2B21K3 e L3A21K6 nel siero dolce sono mostrate nella Figura 2. Entrambi i ceppi hanno mostrato un incremento significativo (p < 0,05) delle cellule vitali nel corso delle 72 ore di incubazione, con un aumento da 8,33 a 9,69 Log CFU/mL per L2B21K3 e da 8,76 a 9,70 Log CFU/mL per L3A21K6. La produzione di batteriocina è stata rilevata già dopo 2 ore, con valori di 3200 AU/mL per L3A21K6 e 6400 AU/mL per L2B21K3. La produzione ha raggiunto il picco dopo 10 ore, con valori di 6400 AU/mL per L3A21K6 e 12.800 AU/mL per L2B21K3, per poi mantenersi costante fino a 48 ore. Tuttavia, dopo 72 ore, la produzione di batteriocina è diminuita.

Fig. 2. Crescita (log CFU/mL) e produzione di batteriocina (AU/mL) di E. faecalis L2B21K3 e L3A21K6 nel siero di latte dolce durante 72 ore di incubazione a 30 °C. Linea fx1 – Conteggi di E. faecalis L2B21K3 (Log CFU/mL); Linea fx2 – Conteggi di E. faecalis L3A21K6 (Log CFU/mL); barre blu – produzione di batteriocina da parte di E. faecalis L2B21K3; barre gialle – produzione di batteriocina da parte di E. faecalis L3A21K6. Diverse lettere minuscole indicano una differenza significativa (p < 0,05) tra i ceppi di E. faecalis , mentre diverse lettere maiuscole indicano una differenza significativa (p < 0,05) nel tempo. ND – Non rilevato.

Le soluzioni di siero di enterocina (EWS) prodotte dai ceppi E. faecalis e incorporate in pellicole di gelatina/glicerolo (EWS L2 ed EWS K6) sono state testate per la loro attività antimicrobica contro L. monocytogenes per 90 giorni a 10 °C. La pastorizzazione ha ridotto l’attività antimicrobica del 50%, ma ha garantito l’assenza di cellule vive nel prodotto. La Tabella 1 riporta i risultati dell’attività antimicrobica, mostrando che i film EWS L2 ed EWS K6 hanno mantenuto la loro capacità inibitoria contro L. monocytogenes per l’intero periodo di conservazione.

Tabella 1. Attività antimicrobica di film di gelatina/glicerolo senza EWS (controllo) e film di gelatina/glicerolo con EWS L2 o EWS K6 contro L. monocytogenes ATCC 7466, espressa come zona di inibizione (mm) ± SEM. a) ND – Non rilevato, non è stato rilevato alcun alone di inibizione. b)Lettere minuscole diverse come apici nella stessa colonna indicano una differenza significativa ( p  < 0,05).

Il rilascio di batteriocine dai film EWS è illustrato nella Figura 3. I film EWS K6 hanno iniziato a rilasciare batteriocine dal quinto giorno (1600 AU/mL), raggiungendo il massimo al quindicesimo giorno (3200 AU/mL) e mantenendo tale valore costante fino al trentesimo giorno. I film EWS L2 hanno mostrato un rilascio più lento, con il picco di batteriocine (400 AU/mL) raggiunto al ventesimo giorno.

Fig. 3. Diffusione della batteriocina attraverso pellicole di gelatina/glicerolo EWS immerse in soluzione simulante conservate a 10 °C per 30 giorni. Barre verdi: pellicole EWS L2 e barre blu: pellicole EWS K6. Diverse lettere minuscole indicano una differenza significativa (p < 0,05) tra i ceppi di E. faecalis , mentre diverse lettere maiuscole indicano una differenza significativa (p < 0,05) tra i tempi. ND – Non rilevato.

L’efficacia dei film EWS nel prevenire la contaminazione dei formaggi con L. monocytogenes è illustrata nella Figura 4. Nei formaggi rivestiti con i film EWS K6, la carica batterica è diminuita di 2 unità logaritmiche dopo 15 giorni e non è stata rilevata dopo il ventesimo giorno. I film EWS L2 hanno mostrato una diminuzione simile, ma con un ritardo maggiore. I film di controllo SW non hanno mostrato alcuna attività inibitoria.

Fig. 4. Vitalità delle cellule L. monocytogenes ATCC 7466 (Log CFU/mL) in campioni di formaggio contaminati confezionati in pellicole di gelatina/glicerolo EWS conservate a 10 °C per 30 giorni. Controllo  linea verde (pellicola SW); pellicola EWS L2 con linea gialla; e pellicola EWS K6 con linea blu.

I film bioattivi formulati erano flessibili, omogenei, trasparenti e lucidi, con un colore giallognolo chiaro dopo la fusione. Le superfici erano lisce e prive di crepe visibili, ma dopo il distacco dalle piastre di fusione, i film tendevano a diventare biancastri e opachi con il passare del tempo.

L’aggiunta di EWS ha aumentato lo spessore dei film rispetto al controllo (SW), con valori significativamente più elevati per il film EWS K6 (p < 0,05). Questo effetto è attribuito all’interazione tra le batteriocine e le proteine del siero del latte, che formano una rete tridimensionale più porosa e idratata, come riportato da Beristain-Bauza et al. (2016).

Tabella 2. Spessore , contenuto di umidità, solubilità, rigonfiamento, velocità di trasmissione del vapore acqueo (WVTR), permeabilità al vapore acqueo (WVP), velocità di trasmissione del limonene (LTR), permeabilità al limonene (LP), resistenza alla trazione e allungamento a rottura di film di gelatina/glicerolo senza EWS (controllo) e film di gelatina/glicerolo con EWS L2 o EWS K6.

I film con EWS hanno mantenuto un WVTR inferiore rispetto ad altri film bioattivi con antimicrobici, garantendo una maggiore protezione contro la perdita di umidità.

Le proprietà meccaniche dei film sono state testate per garantire l’integrità durante la maturazione e la conservazione dei formaggi. La resistenza alla trazione è aumentata significativamente con l’aggiunta di EWS, con valori di 3,23 N/mm² per L2 e 2,86 N/mm² per K6, rispetto ai 1,63 N/mm² del controllo. Tuttavia, non sono emerse differenze significative nell’allungamento a rottura tra le diverse formulazioni. La maggiore resistenza è stata attribuita alla migliore formazione di reti polimeriche interconnesse.

Le proprietà ottiche dei film, che influenzano l’accettazione dei consumatori, sono state monitorate per 30 giorni. La Tabella 3 mostra i valori di colore (L*, a*, b*) e l’opacità per i film bioattivi. La luminosità (L) è aumentata nel tempo, con un valore maggiore per EWS K6. La tonalità (a) tendeva al verde nel tempo, mentre il colore giallo (b) è aumentato nel tempo, con un incremento maggiore per EWS K6. L’opacità è risultata ridotta con l’aggiunta di EWS.

Tabella 3: Valori di colore (L*, a*, b*) e opacità per i film bioattivi.

L’opacità ridotta e il colore giallastro dei film potrebbero influenzare positivamente l’estetica dei prodotti alimentari confezionati, migliorandone l’accettabilità visiva.

Conclusioni​

I film di gelatina/glicerolo preparati con l’incorporazione di EWS contenenti enterocine sintetizzate da E. faecalis L2B21K3 e L3A21K6 hanno mostrato una forte attività antimicrobica che è durata oltre 90 giorni. In un test alimentare, questi film attivi si sono rivelati efficaci nell’inibire il trasferimento di Listeria al formaggio e nel ridurre il conteggio dei patogeni nel rivestimento.

I film hanno mostrato proprietà ottiche, di barriera e meccaniche adatte e hanno fornito una matrice adatta per supportare l’attività dell’enterocina. Pertanto, l’uso di film attivi di gelatina/glicerolo come rivestimenti per formaggi è un metodo promettente per superare i problemi associati alla contaminazione del formaggio post-lavorazione e potrebbe essere un sostituto sicuro per l’uso di imballaggi in plastica ermetici.

Sebbene siano necessari ulteriori studi per determinare le proprietà tossicologiche e sensoriali di questi film, essi rappresentano un’opzione semplice, efficace ed economica per un potenziale utilizzo nella bioconservazione del formaggio. La formulazione di questi film bioattivi rappresenta anche un approccio alternativo all’uso del siero di latte del formaggio.

Si tratta di una pellicola naturale, biodegradabile e sicura che utilizza un sottoprodotto della lavorazione del formaggio come substrato per la produzione di composti antimicrobici e come materiale di imballaggio, soddisfacendo così i requisiti per un imballaggio più sostenibile.

Tratto da: “Application of enterocin-whey films to reduce Listeria monocytogenes contamination on ripened cheese”, Sofia P.M. Silva, Josè A. Teixeira, Cèlia C.G. Silva. Food Microbiology 109 (2023) 104134. https://doi.org/10.1016/j.fm.2022.104134.