Oggigiorno la possibilità di effettuare diagnosi di gravidanza quanto più precocemente possibile in seguito ad inseminazione strumentale rappresenta forse il fattore di maggiore importanza all’interno dell’azienda bufalina. Difatti, il miglioramento dell’efficienza riproduttiva è la chiave nell’ottica della riduzione dell’intervallo interparto e dell’ottimizzazione della redditività dell’impresa zootecnica. In Italia tutto ciò assume un’importanza ancora maggiore, in quanto garantisce la disponibilità di latte nel periodo di maggiore richiesta di mozzarella.

Diversi sono gli approcci seguiti fino ad oggi per cercare di migliorare l’efficienza riproduttiva della mandria e ridurre, di conseguenza, l’intervallo interparto. Attraverso l’applicazione di protocolli di ri-sincronizzazione (re-synch) e mediante approcci ecografici, in particolare con la tecnica eco-color Doppler, l’intervallo interparto è stato ulteriormente ottimizzato, riducendo il periodo tra un’inseminazione andata “a vuoto” e l’altra ad un valore medio di circa 400 giorni. Tuttavia, queste tecniche risultano condizionate in primo luogo dal tempo richiesto dalla diagnosi di gravidanza, che non risulta affidabile al di sotto dei 25 giorni post-IS, ed in secondo luogo dal fenomeno della mortalità embrionale tardiva, che in alcuni casi nella bufala può raggiungere un’incidenza anche del 40%. Il dosaggio del progesterone plasmatico ha permesso invece di formulare diagnosi di gravidanza già a 21 giorni post-IA, caratterizzandosi tuttavia per un’affidabilità ed una specificità non ottimale, a causa della variabilità della durata del ciclo estrale tipica della specie. Sono quindi stati ricercati approcci e metodologie diversi che potrebbero aprire nuove frontiere in questo senso.

La metabolomica è lo studio delle alterazioni delle funzionalità metaboliche dei sistemi biologici mediante tecniche applicate alla caratterizzazione di fluidi e di campioni di tessuto. Rientra nel campo delle cosiddette scienze “omiche”, le quali forniscono strumenti utilissimi alla caratterizzazione di un gran numero di molecole presenti in svariate matrici biologiche. Le metodologie che sono state sviluppate allo scopo di rilevare i metaboliti di interesse includono la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare e la gas cromatografia accoppiata a spettrometria di massa. I livelli dei metaboliti oggetto di studio riflettono lo stato metabolico e di salute dei soggetti esaminati, e possono dunque operare una discriminazione tra fenotipi differenti. La maggior parte degli studi ad oggi presenti in bibliografia si sono concentrati su fluidi biologici di facile reperibilità, quali ad esempio il latte. Esistono evidenze che indicano che la presenza/assenza di specifiche combinazioni di metaboliti nel latte è altamente correlata allo stato fisiologico dell’animale. In più, nel campo della riproduzione risulta oggigiorno confermata l’importanza fondamentale di ormoni che regolano il metabolismo quali ormone della crescita, IGF-1, insulina, leptina e tirossina, e fattori metabolici come ad esempio il glucosio o gli acidi grassi). Sulla base di questi presupposti, la caratterizzazione del metaboloma risulta dunque una frontiera più che promettente con la finalità di diagnosticare lo stato di gravidanza. Avvalendosi di tale background si è deciso perciò di indagare il profilo metabolomico del latte allo scopo di isolare ed identificare nuovi potenziali biomarker utili a una precoce diagnosi di gravidanza in bufale sottoposte ad inseminazione artificiale. Quest’obiettivo può essere raggiunto sia identificando marcatori di gravidanza quali ad esempio composti che differiscono tra bufale gravide e non al giorno 7 e al giorno 18 post-IS, sia registrando una serie di molecole prima dell’inseminazione. Infatti, ai giorni 7 e 18 la gravidanza è effettivamente in essere, mentre eventuali differenze nei metaboliti del latte ai giorni 0 e 10 potrebbero indicare un mancato concepimento (es. sviluppo di un follicolo preovulatorio), e possono essere dunque definiti come marcatori di potenziale concepimento.

Lo studio ha coinvolto 20 bufale caratterizzate da una media di 52 giorni in lattazione ed un ordine di parto medio di 3; queste sono state selezionate a partire da un gruppo più ampio di 31 animali nel periodo di transizione (passaggio da un periodo a fotoperiodo decrescente ad uno a fotoperiodo crescente). Prima dell’inizio dello studio, a 12 giorni di distanza, tutte le bufale sono state valutate clinicamente mediante monitoraggio ecografico volto all’identificazione del corpo luteo. Sono stati inclusi nello studio i soggetti che hanno presentato un corpo luteo funzionale in almeno una delle due indagini ecografiche. Tutte le bufale sono state sottoposte a sincronizzazione dell’ovulazione con protocollo Ovsynch e inseminazione a tempo fisso. Il latte di ciascun soggetto è stato campionato all’inizio del protocollo di sincronizzazione (giorno -10), il giorno dell’IS (giorno 0), 7 e 18 giorni dopo l’inseminazione (giorno 7 e giorno 18). La diagnosi di gravidanza, è stata eseguita mediante approccio ecografico transrettale a 45 e 70 giorni post-IS. In seguito alla diagnosi di gravidanza, come accennato, sono state selezionate 20 bufale in totale (10 gravide e 10 non gravide) ed il latte dei soggetti è stato analizzate retrospettivamente mediante approccio metabolomico. Per quanto concerne i risultati riproduttivi, il tasso di gravidanza evidenziato dopo 27 giorni è stato del 54.8% (17/31), per poi scendere al 45.2% (14/31) al giorno 45, il che vuol dire un’incidenza di mortalità embrionale tardiva del 17.6% (3/17). Le dimensioni del follicolo preovulatorio registrate il giorno del protocollo Ovsynch-TAI sono state significativamente inferiori nelle bufale gravide rispetto a quelle delle bufale non gravide (1,21 cm vs. 1,40 cm). Dal punto di vista produttivo, come descritto in Tabella 1, nessuna differenza è stata evidenziata in termini di media produttiva tra animali gravidi e non gravidi.

Il profilo metabolico del latte delle bufale gravide ha mostrato differenze significative rispetto a quello delle bufale non gravide. Una netta separazione tra i gruppi è stata evidente per quanto concerne le principali componenti della varianza all’interno del dataset della cromatografia liquida accoppiata alla spettroscopia di massa. L’analisi del metaboloma ha evidenziato la presenza di diversi metaboliti espressi in maniera differente nel latte delle bufale gravide rispetto a quelle non gravide. Come riportato in Tabella 2, tra questi metaboliti un totale di 5 è stato isolato attraverso la comparazione con un database online e un composto standard.

Il dato interessante è risultato essere quello legato all’acetilcarnitina che si è caratterizzata per una espressione massima nel latte delle bufale non gravide. Un’analisi mirata a questo specifico metabolita ha evidenziato la sua presenza nei campioni di latte di bufale non gravide a partire dal giorno -10 fino al giorno +18, con una diminuzione consistente nell’arco dei campionamenti. Al contrario, nel latte delle bufale gravide, l’acetilcarnitina è stata osservata soltanto nell’ultimo campionamento (Tabella 3).

I tassi di gravidanza registrati sono paragonabili ai dati presenti in letteratura, stesso dicasi per l’incidenza della mortalità embrionaria tardiva. Sia la stagionalità della specie bufalina che le richieste di mercato risultano infatti fattori predisponenti all’aumento dell’incidenza della mortalità embrionaria fino ad oltre il 40% in alcune aziende. Al contrario, un’incidenza più alta del 10% nella stagione riproduttiva viene registrata molto di rado.

I risultati riportati evidenziano quanto il diametro del follicolo preovulatorio giochi un ruolo chiave nei confronti del miglioramento dell’efficienza dell’IA. Difatti, un diametro follicolare significativamente inferiore è stato registrato nelle bufale gravide rispetto a quello delle non gravide. Diversi studi condotti in ambito bovino hanno già indagato l’effetto deleterio di una prolungata dominanza follicolare sulla competenza oocitaria ed il futuro sviluppo embrionale. Tale dato viene dunque ribadito anche per la specie bufalina, nella quale è probabile che, soprattutto in animali sottoposti a trattamento di sincronizzazione (Ovsynch-TAI), la mancata ovulazione in seguito alla prima somministrazione di GnRH possa rendersi responsabile della persistenza del follicolo dominante. Tale evidenza viene confermata da indagini recenti che descrivono aree del follicolo ovulatorio di dimensioni inferiori rispetto a quelle proprie dei follicoli anovulatori. In più gli animali che rispondono alla prima somministrazione di GnRH si attestano su tassi di ovulazione maggiori anche al secondo GnRH.

Negli animali in lattazione, il latte rappresenta un substrato ideale visto che le procedure per il prelievo risultano semplici, non invasive e prive di qualsiasi stress per gli individui sottoposti ad analisi. I metaboliti presenti a livello ematico si concentrano nel latte attraverso la filtrazione, riflettendo pertanto lo stato metabolico del soggetto. L’impiego della cromatografia liquida accoppiata alla spettroscopia di massa per l’isolamento di nuovi biomarker precoci di gravidanza nel latte di bufala rappresenta una frontiera dal potenziale notevole. Diversi pathway coinvolti nella biosintesi del latte hanno mostrato differenze tra animali gravidi e non gravidi. L’analisi del profilo metabolomico del latte di bufala si è pertanto mostrata uno strumento valido all’identificazione di potenziali marcatori utili a una precoce predizione di gravidanza nelle bufale sottoposte ad inseminazione. La caratterizzazione dell’acetilcarnitina in particolare risulta di grande interesse, essendo presente nei campioni di latte delle bufale non gravide a ciascun campionamento, e solamente al giorno 18 post-IS per le bufale gravide. È ipotizzabile che il precursore dell’acetilcarnitina del latte vada persa o dirottata verso altri tessuti.

Infine, l’applicazione dell’approccio metabolomico sulla matrice lattea ha mostrato potenziale notevole. Tali risultati, se confermati, offrirebbero la possibilità agli allevatori di sfruttare l’estro immediatamente successivo un’inseminazione andata a vuoto, risparmiando molte giornate potenzialmente improduttive.

 

 

Sinossi tratta da: Potential Biomarkers for Early Prediction of Pregnancy in Buffaloes Having Undergone Artificial Insemination.

Donato de Nicola1, Francesco Vinale 12, Angela Salzano1*, Giada d’Errico3, Anastasia Vassetti3, Nunzia D’Onofrio4, Maria Luisa Balestrieri4 and Gianluca Neglia1

1)Department of Veterinary Medicine and Animal Production, University of Naples “Federico II”, 80137 Naples, Italy
2)Institute for Sustainable Plant Protection, National Research Council, 80055 Portici (NA), Italy
3)Department of Agricultural Sciences, University of Naples “Federico II”, 80055 Portici (NA), Italy
4)Department of Precision Medicine, University of Campania Luigi Vanvitelli, 80138 Naples, Italy
*Author to whom correspondence should be addressed.

Animals 2020, 10(5), 758; https://doi.org/10.3390/ani10050758