Il monitoraggio di routine degli agenti patogeni di origine alimentare come Listeria monocytogenes negli ambienti di lavorazione degli alimenti è una necessità per garantire la sicurezza alimentare. Questo studio testa un nuovo metodo che potrebbe essere utilizzato per i test sul campo.

La listeriosi è causata dal batterio Gram-positivo Listeria monocytogenes ed è una delle malattie di origine alimentare più gravi, tanto che in Europa nel 2021 sono stati segnalati un totale di 1276 casi. Una delle principali fonti del patogeno in caso di epidemie di listeriosi sono i latticini, che possono essere contaminati da L. monocytogenes in varie fasi della lavorazione. Pertanto, è necessaria una sorveglianza di routine per L. monocytogenes negli alimenti e nell’ambiente di lavorazione al fine di verificare precocemente la presenza di organismi patogeni e garantire la sicurezza alimentare.

Le metodiche di riferimento che si basano sulla coltura per l’individuazione questo agente patogeno sono costose e richiedono molto tempo. La ricerca sta quindi lavorando alacremente per sostituirle con tecniche più veloci, più pratiche e più accurate.

I metodi di rilevazione

La PCR e la real-time PCR sono due tra le tecniche più diffusamente applicate, ma spesso richiedono una fase di purificazione del DNA molto lunga nel tempo, soprattutto per riuscire a garantire limiti di rilevamento bassi. Un possibile punto di svolta in questo senso è stata la recente scoperta di una nuova classe di sonde chemiluminescenti basate sui diossetani di Schaaps, con un’intensità di emissione luminosa fino a 3000 volte maggiore di quella dei diossetani di Schaaps originali.

Sulla base di ciò sono state sviluppate le cosiddette sonde AquaSpark (AqS) per il rilevamento di agenti patogeni di origine alimentare. Le AqS sono una classe di sonde chemiluminescenti costituite da piccole molecole (luminofori del fenossi-diossetano) che possono legarsi covalentemente a specifici gruppi enzimatici labili. Se sono presenti i batteri bersaglio, che esprimono l’enzima specifico, il gruppo labile dell’enzima verrà scisso, portando ad una reazione chemiluminescente con l’emissione di luce che può essere misurata come unità di luce relativa (RLU).

Un nuovo test diagnostico per Listeria monocytogenes sviluppato da NEMIS Technologies (Zurigo, Svizzera) progettato per il settore alimentare è stato validato dall’Association of Official Agricultural Chemists (AOAC) e viene adottato in un primo prodotto commerciale (N-LightTM L. monocytogenes).

I maggiori vantaggi di questo nuovo metodo, oltre al rapporto costo-efficacia, sono i tempi ridotti di rilevamento poiché è possibile misurare direttamente dal mezzo di arricchimento senza isolare e purificare il DNA bersaglio del batterio. Tuttavia, ad oggi il rilevamento con AqS è limitato in quanto può essere eseguito esclusivamente da campioni non alimentari, come i tamponi. Questo perché i residui della matrice alimentare possono interferire in modo significativo con le molecole dei sensori che emettono luce o perché gli organismi bersaglio possono essere presenti a livelli molto bassi e quindi diventa necessario elaborare grandi volumi di campione, il che aumenta il costo dei mezzi di arricchimento. Per superare questi limiti è possibile applicare metodi di preparazione per ridurre la dimensione del campione, amplificare il target, separare i patogeni e per rimuovere composti inibenti associati alla matrice del prodotto alimentare.

Lo studio

Sulla base di queste considerazioni un gruppo di ricercatori dell’Università di Medicina Veterinaria di Vienna (Austria) ha sviluppato il metodo Matrix-Lysis con l’obiettivo di ridurre al minimo l’interferenza della matrice alimentare e di diminuire i volumi di campione relativamente grandi.

Lo scopo di questo studio proof of principle era di determinare se il metodo Matrix-LYSIS sia in grado di ampliare l’applicazione del rilevamento basato su AqS di L. monocytogenes e se questo metodo combinato possa essere utilizzato per la diagnostica di routine. A questo scopo, è stata eseguita una serie di esperimenti per determinare l’applicabilità generale e il limite di rilevamento del nuovo metodo combinato nel latte e nello yogurt.

I risultati

Il metodo è stato confrontato con la qPCR, ottenendo una specificità relativa del 100% per entrambi gli alimenti e una sensibilità relativa del 100% per il latte e del 96% per lo yogurt, per livelli batterici >1 CFU/ml.

Solo a concentrazioni batteriche iniziali molto basse (<1 CFU/ml) sono stati riscontrati risultati discordanti che evidenziano i vantaggi e i limiti di entrambi i metodi. Pur essendo meno suscettibile alla contaminazione e ai risultati falsi positivi derivanti da cellule non in crescita o morte, la qPCR aveva un limite di rilevamento complessivo leggermente inferiore. Tuttavia, gli autori hanno sottolinato che la qPCR ha un costo analitico maggiore e richiede anche un tempo di analisi aggiuntivo di 24 ore.

Questo studio dimostra la prima applicazione riuscita di un metodo di rilevamento con chemiluminescenza per L. monocytogenes negli alimenti con un elevato potenziale per i test sul campo.

Tratto da: “Rapid detection of Listeria monocytogenes in dairy products by a novel chemilumonogenic approach” di Birgit Bromberger e Patrick-Julian Mester. Food Microbiology, https://doi.org/10.1016/j.fm.2022.104150.